1-11- گیاه­شناسی.. 20

1-12- ریشه. 20

1-13-ساقه. 20

1-14-گل.. 20

1-15-میوه 21

1-16-برگها 21

1-17-کاشت… 23

1-18- برداشت… 24

فصل دوم : بررسی منابع

2-1- نشانگر. 25

2-2-انواع نشانگر. 25

2-2-1-نشانگر RAPD.. 25

2-2-2-نشانگر AFLP. 26

2-2-3-نشانگر SSR.. 27

2-2-4-نشانگر ISSR.. 29

فصل سوم : مواد و روش­ها

3-1- تجهیزات و مواد مورد نیاز جهت آزمون شیمیایی، میکروبی و PCR.. 32

3-1-1- تجهیزات مورد استفاده 32

3ـ1ـ2ـ مواد مورد استفاده 34

3-1-3- بافرها و محلول­ها 34

3-1-3-3- بافر TBE (TRIS-Boric acid-EDTA) 34

3-1-3-4- محلول EDTA.. 35

3-1-3-5- NaOH.. 35

3-1-3-6- CTAB BUFFER.. 35

3-2-خصوصیات مکان آزمایشی.. 35

3-3- طرح آزمایشی و فاکتورهای مورد مطالعه. 35

3-4- نحوه انجام آزمایش… 36

3-4-1-مواد گیاهی.. 36

3-4-2-استخراج DNA ژنومی گیاه 37

3-4-2-1-استخراج DNA ژنومی به روش CTAB.. 37

3-4-2-2-نحوه تهیه ژل الکتروفورز. 38

3-5-انجام واکنش PCR.. 38

3-6-مواد لازم جهت انجام PCR.. 39

3-6-1-آغازگر. 39

3-6-5-آنزیم Taq DNA polymerase. 39

3-7-تنظیم شرایط برای PCR.. 40

3-8-الکتروفورز و رنگ­آمیزی محصول PCR.. 42

3-9-تجزیه و تحلیل داده ها 42

فصل چهارم : نتایج و بحث

4-1-جوانه­زنی و سبز شدن گیاهان. 43

4-2-کمیت و کیفیت DNA استخراجی.. 44

4-3-PCR نمونه­ها 44

4-4- روابط فیلوژنتیک بین ژنوتیپ­ها 45

فصل5 : نتیجه گیری

تفسیر….48

نتیجه­گیری.. 49

بحث… 50

پیشنهادات… 51

منابع فارسی.. 52

منابع انگلیسی.. 59

چکیده

روغن یکی از ضروری ترین مواد غذایی برای تغذیه انسان بوده که کمیت و کیفیت آن تاثیر چشمگیری بر سلامت انسان دارد. دانه­های روغنی دومین منبع غذایی مردم جهان را تشکیل می دهند. آفتابگردان زراعیHelianthus annuusکه جزء گیاهان صنعتی، دیپلوئید با تعداد کروموزوم پایه (x=n=17) دولپه و یکساله است. تنوع موجود در یک ژرم­پلاسم می­تواند، منجر به تولید ارقام بهتر و همچنین استفاده از این تنوع در جهت بهبود خصوصیات رقم زراعی گردد. با توجه به این موضوع لزوم تعیین تنوع ژنتیكی در این گیاه از اهمیت ویژه ای برخوردار است و استفاده از روش های جدید ارزیابی تنوع ژنتیكی به منظور انتخاب والدین دو رگ و تعیین میزان قرابت ارقام ضروری می باشد. دراین ارتباط بهترین روش استفاده از نشانگرهای مولكولی می باشد، زیرا تعیین تنوع به وسیله نشانگرهای مورفولوژیكی با توجه به اثرات متقابل محیط و ژنوتیپ و فنوتیپ گیاهان، كارایی شاخص های مورفولوژیكی را كم می نماید. در این مطالعه به منظور بررسی تنوع ژنتیكی 18 توده آفتابگردان خراسان شمالی از نشانگر مولكولی ISSR كه مبتنی بر PCR است، استفاده شد. برای استخراج DNA از روش CTAB استفاده شد و تكثیر ژنوم نمونه ها با استفاده از 10 پرایمر اختصاصی ISSR انجام پذیرفت. سپس با الكتروفورز ژل آگارز و رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید، قطعات تكثیر شده مورد ارزیابی قرار گرفتند.که از مجموع 101 باند تولید شده 43 باند منومورف و 58 باند از آنها چند شکل بودند. درصد چند شکلی برای هر آغازگر از 75/28 درصد برای آغازگر A11-B22 تا 81/81 درصد برای آغازگر 3RAمتغییر بود. در این بررسی توزیع مقادیر PIC بین 27/0 تا 49/0 با میانگین 45/0 متغییر بود. شاخص نشانگر در آغازگر های مورد مطالعه بین 93/7 تا 51/40 قرار داشت. بیشترین مقدار شاخص نشانگر متعلق به آغازگر RA3 بود که نشان دهنده قدرت تفکیک بالاتر این آغازگر در مقایسه با سایر آغازگرها است. که با توجه به میزان محتوای اطلاعات چند شکلی آغازگرها وشاخص نشانگر، آغازگر های A11 و RA3 و 1RR در بررسی تنوع ژنتیکی مناسب می باشند. میزان فاصله ژنتیکی ژنوتیپ­ها با استفاده از روش UPGMA و در نرم­افزار NTSYS محاسبه و ارتباط ژنوتیپ­ها با استفاده از دندروگرام نشان داده شد. دندروگرام حاصل از تجزیه و تحلیل مجموع الگوهای باندی حاصل از پرایمرهای مورد استفاده، توده­ها را در سطح 5/61 درصد به 6 گروه تقسیم نمود. با توجه به اهداف این تحقیق می­توان به این نتایج رسید که بررسی تنوع ژنتیکی تود­های آفتابگردان با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR امکان پذیر بوده و با استفاده از این نشانگر می­توان توده­های مورد بررسی را به گروه­های مختلف تقسیم­بندی کرد. همچنین به وسیله فاصله ژنتیکی به دست آمده بین توده­ها، با توجه به درصد تشابه آنها می­توان توده­ها با فاصله ژنتیکی بیشتر را جهت استفاده در مراکز تحقیقاتی جهت تولید بذور هیبرید با هتروزیس مطلوب استفاده نمود.

کلمات کلیدی: آفتابگردان، تنوع ژنتیکی، چند­شکلی، نشانگر، ISSR

1-1-اهمیت و ضرورت انجام تحقیق

روغن یکی از ضروری­ترین مواد غذایی برای تغذیه انسان بوده که کمیت و کیفیت آن تاثیر چشمگیری بر سلامت انسان دارد (ناصری, 1375). دانه­های روغنی دومین منبع غذایی مردم جهان را تشکیل می­دهند (باراک[1]، 2006). این محصولات علاوه بر دارا بودن ذخایر اسیدهای­چرب حاوی پروتئین نیز می­باشند. استفاده از پروتئین­های گیاهی به جای گوشت و نیز معرفی دانه­های روغنی جدید مانند سویا و کلزا به بازار­های جهانی سبب اهمیت روز افزون این محصولات شده است. همگام با رشد جمعیت و بهبود سطح زندگی به خصوص در کشور­های در حال توسعه، تقاضا برای روغن­ها و نیز پروتئین­های گیاهی که از محصولات فرعی دانه­های روغنی می­باشد، افزایش یافته است و از این رو یکی از مهم­ترین مسائل مورد بحث در کشاورزی و صنعت کشور­ها به شمار می­رود (کاکای[2] و همکاران، 2009). همچنین افزایش مصرف کنجاله دانه­های روغنی درتغذیه دامو طیور نیز نیاز به تولید دانه­های روغنی را در جهان افزایش داده است (سیداحمدی و کریمی, 1382). اهمیت روغن­های نباتی نیز به دلیل افزایش جمعیت و بالا رفتن میزان مصرف، روز به روز بیشتر می­شود. از این رو لزوم برنامه­ریزی بلند مدت و منسجم با هدف نیل به خود کفایی در تولید روغن خوراکی غیر قابل انکار خواهد بود (شیرانیان و دهشیری[3]، 2003 ).

مصرف روغن در ایران طی سالهای اخیر به دلیل رشد جمعیت و مصرف سرانه، افزایش یافته است، به طوری که با در نظر گرفتن مصرف سرانه 14 کیلو­گرم، سالانه حدود 750 هزار تن روغن مورد نیاز می­باشد. این در حالی است که کمتر از 10% از این روغن، در داخل کشور تولید می­گردد (سپهر و همکاران، 1382)

در حال حاضر بیش از 85% روغن خوراکی مورد نیاز کشور از خارج وارد می­شود که این به نوبه خود سبب وابستگی شدید به واردات روغن و در نتیجه خروج ارز از کشور می­شود با توجه به اهمیت روغن در جیره غذایی انسان، ضرورت کشت دانه­های روغنی و نزدیک شدن به خود کفایی در زمینه تولید روغن مورد نیاز کشور بسیار پراهمیت می­باشد (عطایی­کچویی و همکاران، 1388).

آفتابگردان یکی از مهم­ترین گیاهان روغنی به شمار می­آید که بعد از پنبه و سویا بیش­ترین سهم تولید داخلی را به خود اختصاص داده است (خطیبی و همکاران، 1392) روغن آن به دلیل داشتن اسیدهای چرب غیراشباع فراوان و همچنین فقدان كلسترول از كیفیت بالایی برخوردار است (نظامی و همکاران، 2008). و سطح زیر کشت آن در سال­های اخیر در کشور کاهش یافته است (صفاری، 1381) و درحال حاضر بیش از80000 هکتار می­باشد (رحیمی و همکاران، 1382). این محصول با داشتن حدود 40-50% روغن با کیفیت مطلوب، می­تواند به عنوان یک گیاه زراعی مطمئن در دامنه وسیعی از شرایط محیطی، عملکرد قابل توجهی داشته باشد (کریم­زاده­اصل، 1382)

آفتابگردان عمدتا به عنوان یک منبع تامین کننده روغن در جهان مطرح است. و عملکرد آن در خاک­های نسبتا فقیر رضایت­بخش بوده و به همین دلیل در محدوده وسیعی از زمین­های کشاورزی کشت می­شود. به گرما و سرما مقاوم است در مواردی که درجه حرارت از 10 درجه سانتی­گراد کمتر نشود، رشد نمو آن رضایت­بخش خواهد بود این درجه حرارت کمتر را بدون صدمه می­تواند تحمل کند این سازگاری مطلوب باعث گردیده که کشت آن در شرایط اقلیمی متفاوت امکان­پذیر گردد (کوچکی و همکاران، 1367).

1-2-پرسش تحقیق

آیا امکان بررسی تنوع ژنتیکی توده­های بومی آفتابگردان استان خراسان شمالی با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR وجود دارد؟

آیا در بین توده­های مورد بررسی تنوع ژنتیکی وجود دارد؟

1-3-اهداف تحقیق

ارزیابی امکان استفاده از نشانگر مولکولی ISSR در بررسی تنوع ژنتیکی آفتابگردان

بررسی تنوع ژنتیکی توده[4]­های آفتابگردان مورد بررسی با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR

تعیین میزان فاصله ژنتیکی بین توده­های مورد بررسی و استفاده از اطلاعات به دست آمده در مراکز تحقیقاتی

1-4-فرضیه­ها

تنوع ژنتیکی بین توده­های بومی آفتابگردان استان خراسان شمالی وجود دارد.

برای تشخیص تنوع ژنتیکی آفتابگردان، می­توان از نشانگرهای مولکولی استفاده کرد.

روش ISSR روش مناسبی برای بررسی تنوع ژنتیکی است.

1-5-هنر و دانش اصلاح نباتات

هنر اصلاح نبات به مهارت اصلاح کننده در مشاهده و تشخیص خصوصیات اقتصادی، محیطی، تغذیه­ای یا ارثی وابسته است. قبل از اینکه اصلاح کنندگان، آگاهی و دانش کنونی را کسب نمایند، به طور عمده به مهارت و داوری خود در انتخاب گیاهان جدیدی که به طریق بذر یا رویشی تکثیر می­شد تکیه داشتند. بنابراین انتخاب، قدیمی­ترین شکل اصلاح نبات بود (اسلیپر و پولمن[5]، 1387).

اگرچه، گیاهان زراعی در ابتدا به واسطه نتایج جستجوی غیرهدفمند انسان (برای منابع مناسب غذا) رو به تکامل نهادند اما امروزه این امر بیشتر از طریق برنامه­های اصلاحی مدبرانه حاصل می­شود. در حالیکه تغییرات در فعالیتهای زراعی و مکانیزاسیون کشاورزی، تاثیر چشمگیری بر بهره­وری زراعی داشته اند، بهبود عملکرد اغلب گیاهان به سبب بهبود ژنتیکی آنها بوده است. علیرغم پیشرفتهای حاصله، بهبود بیشتر عملکرد و کیفیت محصولات، به سبب رشد جمعیت، افزایش قیمت نهاده­هایی چون آب، کود و انرژی و ملاحظات مربوط به اثرات کودها و سموم شیمیایی بر زیست بوم و تغییر سریع صلایق مصرف کنندگان، مورد درخواست مستمر قرار دارد (دارویس و سولار[6]، 1983). با پیشرفت دانش ژنتیک و سایر علوم گیاهی وابسته، اصلاح نباتات به علم تبدیل گردید. اصلاح نباتات بر پایه­ی تشخیص ژن به عنوان واحد وراثت، روشهای تغییر و تحول ژنی و نقش رفتار ژنتیکی، که امکان برآورد دقیق نتایج حاصل از تغییر و تحول ژنی را می­دهد بنیان نهاده شد. ژنها با آثارشان بر روی ظهور قابل مشاهده­­ی صفات گیاهی نظیر پاکوتاهی یا پابلندی یا رنگ سفید یا صورتی گل شناسایی می­شدند. از طریق دگرگرده­افشانی مهار شده ترکیبات ژنی ویژه­ای از صفات مطلوب مختلف به داخل یک رقم گیاهی ادغام می­گردید.اخیرا دانش ژنتیک مولکولی برای پیشرفت اصلاح نبات، به سطح بالاتری از تکنیک تجربی ارائه گردیده است. ژنتیک مولکولی در توصیف ساختار شیمیایی اسید دی­اکسی­ریبونوکلئیک (DNA)، ماده­ای که سازنده­ی ژن است، مشارکت دارد (اسلیپر و پولمن, 1387).

1-6-چرا گیاهان اصلاح می­شوند؟

هدف اصلاح نبات تغییر وراثت گیاهی به روش­هایی است که عملکرد گیاهی را بهبود بخشد. بهبود عملکرد گیاهی از راه­های بسیاری مورد عمل قرار می­گیرد. معمولا اهداف اصلی به­نژادی افزایش عملکرد و کیفیت است اگرچه محصول برداشتی دانه، علوفه، الیاف، میوه، غده، گل و یا سایر اندام­های گیاهی باشد، منشا اصلی غذای مردم جهان می­باشند. عملکرد بالاتر محصولات گیاهی تاثیر مهمی در تامین غذای فراوان و سودمندتر شدن کشاورزی و کاهش هزینه­ی محصولات غذایی برای مصرف کننده بر عهده دارند. به­نژادی برای بهبود کیفیت در غذاهای گیاهی، موجب مغذی­تر شدن محصول و افزایش سهولت در تهیه غذا یا کاهش حضور ترکیبات سمی می­گردد. افزایش سلامت گیاه بر اثر به­نژادی، که منجر به مقاومت در برابر بیماری و آفت می­شود، عملکرد و کیفیت محصول را در محیطی با عملیات زراعی مطلوب افزایش می­دهد و مصرف سموم شیمیایی را کاهش می­دهد (اسلیپر و پولمن, 1387).

1-7-تنوع ژنتیکی^[7]

1-7-1-تنوع ژنتیکی و اهمیت مطالعه آن

تنوع، مبنای همه گزینش­هاست. انتخاب ژنوتیپی نیز نیازمند تنوع می­باشد. با بالا رفتن تنوع ژنتیکی در یک جامعه حدود انتخاب چه در انتخاب طبیعی و چه بطور مصنوعی وسیع­تر می­شود. با توجه به رابطه مثبت دربین کمیت تنوع ژنتیکی و مقدار وقوع تغییرات تکاملی در آن رابطه مشابهی نیز در بین کارایی بهبود ژنتیکی اصلاح یک جامعه و تنوع ژنتیکی برای صفت مورد علاقه موجود است (عبد­میشانی و شاه­نجات­بوشهری، 1376).

جایگزینی ارقام محلی توسط ارقام جدید و خالص (و تولید وسیع یک رقم برتر) تنوع ژنتیکی را در برنامه­های زراعی کاهش داده است. خطری که وجود دارد این است که برای برنامه­های اصلاحی آینده ممکن است با روند توسعه صنعتی و کشاورزی فشرده در مناطق تنوع ژنتیکی، منابع ژنتیکی ارزشمند از دست بروند (رنجبر، 1386).

تنوع بین گیاهان یک گونه خاص بر دو نوع است، تنوع بر اثر محیط که گیاه به مقادیر مختلف تنش محیطی واکنش می­دهد و با مقایسه گیاهان دو جمعیتی که از لحاظ ژنتیکی یکنواخت هستند، می­توان آنرا مشاهده نمود. تاثیر محیط روی یک گیاه، به نتاج آن منتقل نمی­شود و بنابر این نژاد­های انتخاب شده واکنش یکسانی به تنش­های محیطی خواهند داشت. دسته دوم تنوع ارثی است، این نوع تنوع، به تنوع موجود در یک جمعیت مخلوط ژنتیکی، که از عوامل ارثی ناشی شده و به نتاج انتقال می­یابد، اطلاق می­گردد. از آنجا که این نوع تنوع، ناشی از عوامل ارثی است و قابلیت انتقال به نتاج را دارد، لذا در اصلاح نباتات و برنامه­های اصلاحی حائز اهمیت است. منشاء تنوع ارثی در گیاهان نوترکیبی­های ژنتیکی، تغییرات در کروموزوم­ها و جهش[8]­ها می­باشد (محسنی­فرد، 1386).

تنوع موجود در یک ژرم­پلاسم می­تواند، منجر به ارقام بهتر و همچنین استفاده از این تنوع در جهت بهبود خصوصیات رقم زراعی گردد (ارزانی، 1380). طراحی و اجرای یک برنامه اصلاح نباتات برای اصلاح یک صفت کمی، تا حد زیادی به میزان تنوع ژنتیکی ژرم­پلاسم بستگی دارد. مطالعه پلی­مورفیسم در میان ژرم­پلاسم، فرصت گزینش والدین مناسب جهت تلاقی را فراهم می­آورد. انتظار می­رود این والدین در تلاقی با هم نتاج برتری تولید کرده و میانگین صفات را در جمعیت بالا ببرند. همچنین بررسی تنوع ژنتیکی و تعیین فاصله ژنتیکی نسبی موجود بین افراد یا جمعیت­ها در برنامه­های اصلاحی اهمیت ویژه­ای دارد، زیرا سازماندهی ژرم­پلاسم و گزینش، بطور موثری انجام می­شود. در آغاز یک برنامه اصلاحی، آگاهی از روابط خویشاوندی و فیلوژنی در میان ژنوتیپ­ها تکمیل کننده اطلاعات فنوتیپی، در پیشبرد اصلاحی جمعیت­ها است. همچنین اطلاع از شباهت­های ژنتیکی در بین ژنوتیپ­ها موجب می­شود انتخاب والدین در یک تلاقی، بطور موثرتری انجام پذیرد (نلی[9] و همکاران، 1999).

1-7-2-فرسایش ژنتیکی[10]

1-12-4- گل …………………………………………………………………………………………………………………. 22

1-12-5- غلاف ……………………………………………………………………………………………………………… 22

1-12-6- بذر ………………………………………………………………………………………………………………….. 23

1-13- جوانه زنی …………………………………………………………………………………………………………… 23

1-14- سطح زیر کشت و عملکرد گیاه مورد بررسی …………………………………………… 23

فصل دوم:ی بر تحقیقات انجام شده

2-1- نشانگرها ………………………………………………………………………………………………………………… 25

2-2- انواع نشانگر …………………………………………………………………………………………………………… 25

2-2-1- نشانگر RAPD …………………………………………………………………………………………….. 25

2-2-2- نشانگر RFLP ………………………………………………………………………………………………. 27

2-2-3- نشانگر AFLP ………………………………………………………………………………………………. 28

2-2-4- نشانگر SSR ………………………………………………………………………………………………….. 30

2-2-4- نشانگر 31

2-2-4-2- نقشه یابی ژنوم ………………………………………………………………………………………….. 32

2-2-4-3- برچسب زنی ژن و گزینش به کمک مارکر ……………………………………….. 32

2-2-4-4- تنوع ژنتیکی و آنالیز فیلوژنتیکی …………………………………………………………… 33

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1- تجهیزات و مواد موردنیاز جهت آزمون شیمیایی، میکروبی و PCR …….. 36

3-1-1- تجهیزات مورد استفاده ………………………………………………………………………………… 36

3-1-2- مواد مورد استفاده …………………………………………………………………………………………. 37

3-1-3- بافرها و محلول ها …………………………………………………………………………………………. 38

3-1-3-1- بافر TBE (TRIS-Boric acid- EDTA) ……………………………….. 38

3-1-3-2- محلول EDTA ………………………………………………………………………………………. 39

3-1-3-3- NaOH ……………………………………………………………………………………………………… 39

3-1-3-4- CTAB BUFFER…………………………………………………………………………….. 39

3-2- خصوصیات مکان آموزشی ……………………………………………………………………………….. 39

3-3- طرح آزمایشی و فاکتورهای مورد مطالعه …………………………………………………….. 40

3-4-1- مواد گیاهی ……………………………………………………………………………………………………… 40

3-4-2- استخراج DNA ژنومی گیاه ……………………………………………………………………… 41

3-4-2-1- استخراج DNA ژنومی به روش CTAB ……………………………………….. 41

3-4-2-2- نحوه تهیه ژل الکتروفورز ………………………………………………………………………… 42

3-5- انجام واکنش PCR …………………………………………………………………………………………… 43

3-6- مواد لازم جهت انجام PCR ……………………………………………………………………………. 43

3-6-1- آغازگر ……………………………………………………………………………………………………………….. 43

3-6-2- آنزیم Taq DNA Polymerase …………………………………………………………. 44

3-7- تنظیم شرایط برای PCR ………………………………………………………………………………… 44

3-8- الکتروفورز و رنگ آمیزی محصول PCR …………………………………………………….. 46

3-9- تجزیه و تحلیل داده ها ……………………………………………………………………………………… 46

فصل چهارم: نتایج و بحث

4-1- جوانه زنی و سبز شدن گیاهان ……………………………………………………………………….. 4٧

4-2- کمیت و کیفیت DNA استخراجی ………………………………………………………………. 4٨

4-4- روابط فیلوژنتیک بین ژنوتیپ ها ……………………………………………………………………… ٤٩

فصل پنجم: نتیجه گیری

5-١- نتیجه گیری …………………………………………………………………………………………………………. 5٢

5-٢- بحث ………………………………………………………………………………………………………………………. 5٣

5-٣- پیشنهادات ……………………………………………………………………………………………………………. 5٤

منابع فارسی …………………………………………………………………………………………………………………….. 5٥

منابع انگلیسی ………………………………………………………………………………………………………………….. 6٣

چکیده انگلیسی 6٧

چکیده

حبوبات دانه­های خوراکی هستند که به خانواده بقولات تعلق دارند. حبوبات بعد از غلات مهمترین منبع غذایی بشر به حساب می­آیند. عدس زراعی گیاهی از جنس Lens، گونه culinaris متعلق به تیره لگومینوزه، زیر­خانواده پروانه­آسا، از قبیله Vicieae می­باشد. عملیات اصلاحی در عدس در مقایسه با سایر محصولات مهم زراعی از قدمت کمتری برخوردار است و فعالیت نسبتا جدیدی است. با توجه به این موضوع لزوم تعیین تنوع ژنتیكی در این گیاه از اهمیت ویژه ای برخوردار است و استفاده از روش های جدید ارزیابی تنوع ژنتیكی به منظور انتخاب والدین دو رگ و تعیین میزان قرابت ارقام ضروری می باشد. دراین ارتباط بهترین روش استفاده از نشانگرهای مولكولی می باشد، زیرا تعیین تنوع به وسیله نشانگرهای مورفولوژیكی با توجه به اثرات متقابل محیط و ژنوتیپ و فنوتیپ گیاهان، كارایی شاخص های مورفولوژیكی را كم می نماید. در این مطالعه به منظور بررسی تنوع ژنتیكی 18 توده عدس خراسان شمالی از نشانگر مولكولی ISSR كه مبتنی بر PCR است، استفاده شد. برای استخراج DNA از روش CTAB استفاده شد و تكثیر ژنوم نمونه ها با استفاده از 10 پرایمر اختصاصی ISSR انجام پذیرفت. سپس با الكتروفورز ژل آگارز و رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید، قطعات تكثیر شده مورد ارزیابی قرار گرفتند که از مجموع 125 باند تولید شده 32 باند منومورف و 93 باند از آنها چند شکل بودند. درصد چند شکلی برای هر آغازگر از 5/28 درصد برای آغازگر E55تا 3/92 درصد برای آغازگر B22متغییر بود. در این بررسی توزیع مقادیر PIC بین 28/0 تا 49/0 با میانگین 45/0 متغییر بود. شاخص نشانگر در آغازگر های مورد مطالعه بین 9/7 تا 2/45 قرار داشت. بیشترین مقدار شاخص نشانگر متعلق به آغازگر B22 بود که نشان دهنده قدرت تفکیک بالاتر این آغازگر در مقایسه با سایر آغازگرها است. که با توجه به میزان محتوای اطلاعات چند شکلی آغازگرها وشاخص نشانگر، آغازگر­های B22 و RA3 و RR1 در بررسی تنوع ژنتیکی مناسب می­باشند. میزان فاصله ژنتیکی ژنوتیپ­ها با استفاده از روش UPGMA و در نرم­افزار NTSYS محاسبه و ارتباط ژنوتیپ­ها با استفاده از دندروگرام نشان داده شد. دندروگرام حاصل از تجزیه و تحلیل مجموع الگوهای باندی حاصل از پرایمرهای مورد استفاده، توده­ها را در سطح 5/61 درصد به 4 گروه تقسیم نمود. با توجه به اهداف این تحقیق می­توان به این نتایج رسید که بررسی تنوع ژنتیکی توده­های عدس با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR امکان پذیر بوده و با استفاده از این نشانگر می­توان توده­های مورد بررسی را به گروه­های مختلف تقسیم­بندی کرد. همچنین به وسیله فاصله ژنتیکی به دست آمده بین توده­ها، با توجه به درصد تشابه آنها می­توان توده­ها با فاصله ژنتیکی بیشتر را جهت استفاده در مراکز تحقیقاتی جهت تولید بذور هیبرید با هتروزیس مطلوب استفاده نمود.

کلمات کلیدی: تنوع ژنتیکی، چند­شکلی، عدس، نشانگر، ISSR

فصل اول:مقدمه

١-١-اهمیت و ضرورت انجام تحقیق

بقولات از متنوع­ترین تیره­های گیاهی جدا گلبرگ بوده که بعد از تیره کاسنی و ثعلب در رده نهاندانگان قرار دارند. این تیره مشتمل بر حدود ٧٥٠ جنس و ٢٠٠٠ گونه می­باشد (هیکی و کینگ، ١٩٩٧). از ویژگی­های مشترک تیره بقولات می­توان به وجود تخمدان یک برچه و آزاد، که پس از رسیدن تشکیل میوه­ای بنام لگوم یا غلاف (نیام) را می­دهد، اشاره کرد (مجنون حسینی، ١٣٨٧).

حبوبات دانه­های خوراکی هستند که به خانواده بقولات تعلق دارند (اسدی­چالش­تری و همکاران، ١٣٨٥). حبوبات بعد از غلات مهمترین منبع غذایی بشر به حساب می­آید. پروتئین حبوبات در جوامع بشری به خصوصاقشار کم درآمدنقش مهمی در تغذیه ایفا می­کند تا به آن حد که به گوشت فقرا معروف شده است (کوچکی و بنایان، ١٣٧٥). گیاهان خانواده لگومینوزه، در دوران کرتاسه پیدا شده­اند و به شرایط مرطوب آن زمان، که مشابه شرایط گرم و مرطوب امروزی است، سازگار شدند. بطور کلی اکثر گیاهان خانواده لگومینوزه به مناطق گرم سازگار شده­اند. ولی یکی از زیرخانواده­های آن، یعنی پروانه­آساها، دارای انعطاف زیادی بوده و به مناطق معتدل و سرد معتدله سازگار شده­اند (کوچکی، ١٣٨٨). این گیاهان منبع مهم ویتامین­هایی مانند ریبوفلاوین، ویتامین ب و کاروتن می­باشند و از لحاظ اسیدهای آمینه ضروری مخصوصا لیزین که کمبود آن در غلات وجود دارد غنی هستند (سینگ و همکاران، ١٩٨٢). طبق مطالعات انجام شده ترکیب مناسبی از پروتئین حبوبات با غلات می­تواند سوء تغذیه و کمبود اسیدهای آمینه را برطرف کند. در کشورهای در حال توسعه تقریبا یک چهارم نیاز پروتئینی توسط حبوبات تامین می­شود و عدس با دارا بودن حدود ٢٨ درصد نقش مهمی را در تغذیه مردم ایفا می­کند (پارسا و همکاران، ١٣٨٤). در میان گیاهان مناطق خشک و نیمه خشک، عدس از جمله گیاهانی است که غالبا در اراضی حاشیه­ای و در خاک­های نه چندان حاصلخیز کشت می­شود. این گیاه همچنین قادر است که از طریق تثبیت نیتروژن موجب بهبود حاصلخیزی خاک شود (استاویر و همکاران، ٢٠٠٣). مهمترین قاره تولید کننده عدس آسیاست که ٦٨ درصد کل تولید جهان را در اختیار دارد (توکلی، ١٣٨٢). معمولا گونه­های عدس را به دو گروه اصلی تقسیم می­کنند (کوچکی و بنایان، ١٣٧٥) :

١-میکرواسپرما : با بذرهای ریز گرد به قطر ٢ تا ٦ میلیمتر که رنگ پوسته بذر آن از زرد کمرنگ تا سیاه متغیر است.

٢-ماکرواسپرما : در این گروه بذرهای بزرگ­تر و پهن­تر هستند و رنگ پوسته بذر سبز کمرنگ است. این گروه از گیاهان دارای غلاف­ها و برگچه­های بزرگ­تری نسبت به گروه قبلی هستند. بطور کلی گیاهان میکرواسپرما قدیمی­تر بوده و گیاهان ماکرواسپرما از میان آنها انتخاب شده­اند.

عدس نسبت به سایر حبوبات دارای مدت پخت کوتاه­تری است و راحت­تر هضم می­گردد (وب و هوتین، ١٣٧٦). عدس در رفع یبوست و اختلالات روده­ای مفید است، همچنین در جلوگیری از سکته نیزموثر می­باشد. مرهم خمیر عدس جهت التیام زخم­های باقی مانده از آبله در طب سنتی توصیه شده است (مجنون ­حسینی، ١٣٨٧). مقدار پروتئین عدس با باقلا برابر و از نخود بیشتر است. عدس سرشار از آهن است و همچون باقلا و نخود منبع خوبی برای تیامین و نیاسین بوده، اما از نظر ویتامین B و کاروتن نسبتا فقیر است (نامدار و همکاران، ١٣٧٤). اگرچه عدس اساسا در تغذیه انسان استفاده می­شود ولی از آن در تغذیه حیوانات به ویژه ماکیان نیز استفاده می­گردد. کاه و دیواره­های غلاف و بقایای ناشی از کوبیدن آن از ارزش تغذیه­ای زیادی برای دام برخوردارند (وب و هوتین، ١٣٧٦).

عدس یکی از قدیمی­ترین گیاهان زراعی است که منشاء آن خاک­های حاصلخیز خاور نزدیک می­باشد. قدمت این گیاه به شروع کشاورزی باز می­گردد. در مقبره فراعنه مصر آثار خمیری محتوی عدس پخته بدست آمده است. نویسندگان یونانی در آثار خود به نام عدس اشاره داشته­اند و به نظر می­رسد که این گیاه به عنوان هدیه­ای برای خدایان مورد استفاده قرار می­گرفته است. رومیان نیز ارزش زیادی برای عدس قائل بوده­اند به­طوری که آن را از مصر وارد می­کرده­اند (کوچکی و بنایان، ١٣٧٥). نام عدس در کتاب­های مقدس دینی نظیر انجیل و قرآن ذکر شده است. در قرآن (سوره بقره) عدس یکی از محصولات زمینی بوده

که یهودیان از موسی(ع) خواستند که از خداوند برایشان درخواست نماید (وب و هوتین، ١٣٧٦). یکی از قدیمی­ترین آثار گیاهان خوراکی بقایای عدس است که مربوط به ٧٥٠٠ تا ٨٥٠٠ سال قبل از میلاد مسیح می­باشد (پارسا و باقری، ١٣٨٧).

به نظر می­رسد که عدس در منطقه­ای بین جنوب­غربی ترکیه و ترکمنستان از نژادهای وحشی خود اهلی شده است و به سمت نیل، یونان، اروپای مرکزی و متعاقب آن به سمت دانوب گسترش یافته باشد. بر اساس نظریه­های موجود عدس به دلیل نیازهای متفاوت اکولوژیکی موجود در گونه­های وحشی، پراکنش متفاوتی داشته و به مناطقی با شرایط مدیترانه­ای و همچنین در نواحی کوهپایه­ای جنوب­غربی آسیا سازگار شده است (کوچکی و بنایان، ١٣٧٥).

اصلاح کنندگان نباتات که در جهت دست­یابی به تنوع ژنتیکی موجود در کلکسیون ژرم­پلاسم فعالیت می­کنند، نیاز به داشتن اطلاعاتی در مورد میزان تنوع دارند. عملیات اصلاحی در عدس در مقایسه با سایر محصولات مهم زراعی از قدمت کمتری برخوردار است و فعالیت نسبتا جدیدی است. بهبود در عدس عمدتا بر اساس معرفی مواد انتخاب شده برای سازگاری به نواحی خاصی بوده است. در نتیجه بیشتر ارقام مورد استفاده امروزی بر اثر انتخاب در جمعیت­های نامتجانس بدست آمده و از عملیات هیبریداسیون استفاده نشده است. پیشرفت با استفاده از این روش محدود به تنوع موجود در این توده­ها و پیشرفت­های اصلاحی بعدی بستگی به هیبریداسیون و انتخاب خواهد داشت. کلکسیون­هایی برای حفاظت از ژرم­پلاسم عدس در آمریکا، هندوستان و سوریه ایجاد شده و از این نظر که تنوع ژنتیکی مورد نیاز برنامه­های اصلاحی هیبریداسیون را فراهم می­کند ارزشمند است.

با استفاده از روش­های انتخاب توده­ای والدین خالص در داخل ژرم­پلاسم یا نژادهای بومی می­توان به سهولت و سرعت به پیشرفت­های قابل توجهی دست یافت. این رو­ش­ها می­توانند در کوتاه مدت نیاز به واریته­های اصلاح شده و همچنین مواد ژنتیکی یکنواخت مورد نیاز در برنامه­های هیبریداسیون را فراهم کنند.

انتخاب توده­ای دو نوع گزینش را دربر می­گیرد :

١-حذف تیپ­های نامطلوب از یک مخلوط یا جمعیت­های متنوع و برداشت گیاهان باقی­مانده به صورت مخلوط.

٢-شناسایی تیپ­های برتر در جمعیت از طریق علامت­گذاری و یا هر روش دیگر و برداشت آنها به صورت مخلوط، نتیجه نهایی این دو روش کاهش فراوانی ژنوتیپ­های نامطلوب و افزایش فراوانی ژنوتیپ­های مطلوب خواهد بود.

انتخاب توده­ای ممکن است در هر نوع از منبع ژنتیکی (مثل نژادهای بومی، جمعیت­های هیبرید) که دارای تغییرات ژنتیکی کافی باشد و موفقیت را تضمین کند انجام شود (وب و هوتین، ١٣٧٦).

از آنجا که تنوع، اساس هر برنامه اصلاحی است، به طوری که موفقیت یک برنامه اصلاحی به طبیعت و یا حجم و تنوع موجود در مواد ژنتیکی بستگی دارد. وجود حداکثر تنوع، بزرگترین شانس برای نائل شدن به موفقیت در گزینش محسوب می­شود (میشرا و همکاران، ٢٠٠٧). با توجه به این که ایران یکی از مراکز تنوع عدس در جهان بوده و حتی پراکندگی دو گونه وحشی آن (Lens cyanea و Lens orientalis) نیز گزارش شده است (آقایی و همکاران، ١٣٨٣)، انتظار می­رود تنوع زیادی در میان توده­های بومی این محصول یافت شود. تنوع ژنتیکی بین و داخل جمعیت­های گونه­های گیاهی، یکی از موارد اصلی مورد مطالعه به­نژادگران و متخصصان ژنتیک می­باشد (هایوارد و بریز، ١٩٩٣). مور و کولینز دریافتند که توجه به ژرم­پلاسم گیاهان در طول نگهداری آنها، جهت پیش­بینی پتانسیل ژنتیکی و استفاده از آن در برنامه­های اصلاحی ضرووری است (مور و کولینز، ١٩٩٣). در استان خراسان شمالی عدس با سطح کشت ٢١٣١٢ هکتار که ٢٠٩٠٠ هکتار آن دیم می­باشد و با مقدار تولید ٨٣٦٣ تن بیشترین تولید و سطح کشت در بین سایر حبوبات را به خود اختصاص داده است که این مطلب خود بیان کننده جایگاه ویژه این محصول در استان می­باشد. با توجه به اهمیت گیاه عدس، انجام اقدامات اصلاحی در آن امری بسیار مهم می­باشد.

6

1-4 درجه حرارت

7

1-5 نیاز کودی جو

8

1-6 آبیاری

8

1-7 برداشت

9

فصل دوم: بررسی منابع

10

2-1 مقیاس BBCH

11

2-2 کود زیستی

11

2-3 قارچ مایکوریزا

12

2-4 انواع میکوریزا

13

2-5 فواید همزیستی میکوریزایی

14

2-5-1 میکوریزا و افزایش جذب عناصر غذایی

14

2-5-2 میکوریزا و بهبود جذب آب

15

2-5-3 میکوریزا و جذب مواد غذایی و تاثیر بر عملکرد و اجزا عملکرد

16

2-5-4 کاهش از بین رفتن نهال ها در جابجایی

17

2-6 هیومیک اسید

17

2-6-1 خواص هیومیک اسید

19

2-6-2 هیومکس

20

2-7 ریزمغذی ها

20

2-7-1 بیومین

21

2-8 اثر محلول پاشیاسید هیومیکو اسید بیومین بر عملکرد و اجزا عملکرد

21

2-9 اثر اسید هیومیک بر ماده خشک

23

2-10 اثر اسید هیومیک و بیومین بر عناصر، آنزیم ها، فتوسنتز

23

فصل سوم: مواد و روشها

26

3-1 زمان و محل اجرای آزمایش

27

3-2 ویژگی های خاک محل آزمایش

27

3-3 مشخصات طرح آزمایشی و عملیات اجرایی

27

3-4 صفات مورد مطالعه

28

3-5 صفات زراعی ومورفولوژیک

28

3-6 صفات فیزیولوژیک

28

3-6-1 سنجش پرولین

28

3-6-2 سنجش پروتئین

29

3-6-3 سنجش فسفر

29

3-6-4 سنجش رنگیزه ها

30

3-6-5 سنجش پتاسیم

30

3-6-6 سنجش خاکستر

31

3-6-7 سنجش کربوهیدرات

31

3-6-8 محاسبات آماری

32

فصل چهارم: نتایج و بحث

33

4-1- صفات مورفولوژیک

34

4-1-1- طول ساقه

34

4-1-2- سطح برگ

35

4-1-3- وزن تر ساقه

35

4-1-4- وزن خشک ساقه

4-1-5- وزن تر برگ

4-1-6- وزن خشک برگ

36

37

37

4-2- صفات فیزیولوژیک

40

4-2-1- کلروفیل a

40

4-2-2- کلروفیل b

40

4-2-3- کلروفیل کل

41

4-2-4- کارتنوئید

42

4-2-5- خاکستر

42

4-2-6- فسفر

43

4-2-7- پتاسیم

44

4-2-8- پروتئین

45

4-2-9- کربوهیدرات

46

4-2-10- پرولین

46

4-3- عملکرد و اجزای عملکرد

51

4-3-1- طول سنبله

51

4-3-2- تعداد بوته در متر مربع

52

4-3-3- تعداد دانه در سنبله

53

4-3-4- وزن هزار دانه

53

4-3-5- عملکرد

54

4-4- همبستگی صفات مورفولوژیک و فیزیولوژیک و اجزای عملکرد جو

57

نتیجه گیری کلی

59

پیشنهادات

59

منابع

60

پیوست ها

72

چکیده لاتین

چکیده

به منظور بررسی اثرات محلول پاشی کودهای آلی و کاربرد میکوریزا بر ارقام جو بهاره آزمایشی در سال زراعی 92-91 در شهر مجن از توابع شهرستان شاهرود اجرا گردید. این آزمایش بصورت فاکتوریل در قالب طرح بلوکهای کامل تصادفی در سه تکرار و دو رقم جو بهاره(مجن، کلاته)، قارچ میکوریزا در دو سطح (استفاده از قارچ، عدم استفاده از قارچ) و محلول پاشی در چهار سطح (شاهد(عدم استفاده)، هیومیک 100%، بیومین 100%، هیومیک +بیومین 50%+50% ) در نظر گرفته شدند. نتایج این تحقیق نشان داد که اعمال قارچ میکوریزا و محلول پاشی در زراعت جو بر کلیه صفات زراعی و مورفولوژیک گیاه به جز سطح برگ در سطح احتمال 5 درصد معنی دار بود. همچنین استفاده از قارچ میکوریزا باعث افزایش میزان خاکستر، فسفر، پروتئین، کلروفیل a و b و کل و کارتنوئید گردید، محلول پاشی 100%بیومین و هیومیک+بیومین تاثیر بیشتری بر افزایش انواع رنگیزه ها داشت. بررسی ها نیز نشان داد که رقم محلی مجن در صفاتی از قبیل طول ساقه، وزن تر و خشک ساقه، وزن تر و خشک برگ،پتاسیم، پرولین، وزن هزار دانه و در نتیجه عملکرد بیشترین مقدار را کسب کرد. نتایج محلول پاشی نیز نشان داد که محلول پاشی هیومیک باعث افزایش وزن هزاردانه (89/44 گرم) شد. محلول پاشی هیومیک +بیومین در بیشتر صفات مورفولوژیک و فیزیولوژیک و اجزا عملکرد دانه به جز برخی از صفات مورد مطالعه شامل طول ساقه، سطح برگ، وزن تر و خشک برگ، پرو تئین و کربو هیدرات بیشترین میزان را حاصل شد. نتایج این ازمایش نشان می دهد که کودهای آلی و قارچ میکوریزا اثرات مثبتی بر صفات مورد آزمایش داشتند.

کلمات کلیدی: ارقام جو، کودها آلی، میکوریزا، صفات زراعی، فیزیولوژیک

-1 مقدمه

کشاورزی پایدار نوعی کشاورزی است که در جهت منافع انسان بوده، کارایی بیشتری دراستفاده از منابع داشته و با محیط در توازن است، به عبارتی کشاورزی پایدار باید از نظر اکولوژی مناسب، از نظر اقتصادی توجیه پذیر، از نظر اجتماعی مطلوب و از نظر فرهنگی مورد قبول و قابل اجرا باشد (کهنسال و زارع،1378).

همچنین کشاورزی پایدار نیازمند تعهد و تغییر ساختارهای عمومی سیاسی، نهادهای دولتی، هنجارها و ارزش های اجتماعی و فرهنگی است، به بیانی دیگر می توان گفت که کشاورزی پایدار به معنای استفادهاز مناسب ترین روش تولید، مطابق با اکوسیستمهای طبیعی و همچنین با بیشترین میزان تولید، در کشاورزی است در حالی که در کشاورزی تجاری برای نیل به اهداف تولید کوتاه مدت از نهاده های کشاورزی به طور بی رویه استفاده می شود، این نهاده ها شامل کود، سم، زمین، آب، نیروی کار، سرمایه و فناوری است که استفاده های بی رویه از هرکدام، ناهنجاریهایی را به دنبال دارد با افزایش روزافزون جمعیت و نیازهای فراوان آنان از جمله غذا، کشاورزی به روشهای ابتدایی و سنتی با بازدهی کم، دیگر جوابگو نیست، در طی سالهای گذشته با قطع درختان جنگلی و از بین بردن مراتع، سطح زیر کشت زمین های زراعی افزایش و با استفاده از تکنولوژی های صنعتی و روشهای نوین کشاورزی تا حدودی این نیازها برآورده شده است، به کارگیری روشهای شیمیایی و مکانیکی هرچند توانست کشاورزی را رونق دهد، ولی جاذبه های منافع کوتاه مدت کشاورزی تجاری به سیستم حساس و آسیب پذیر خاک، این اجازه را نداد که بگوید: چه مدت می توان ازاین روش کشاورزی استفاده کرد (کروز[1]،2004).

در کشاورزی تجاری بااستفاده بی رویه و نامتعادل از کودها و سموم که تخریب خاک و از بین رفتن موجودات خاکزی را در پی داشت، توان تولید و حاصلخیزی خاک کاهش یافته و نتیجه این روش کشاورزی، پایین آمدن کیفیت محصولات می باشد (ساد[2]،2007).

به طور کلی باید گفت: کشاورزی پایدار از اهدافی است که باید هرچه سریعتر به آن دست یافت و با استمرار آن نیاز به مواد شیمیایی گران و مخرب را کمتر کرد و با حفاظت از محیط زیست، موجودات و سلامتی جوامع زیستی از طریق برنامه ریزی دقیق، کشاورزی پایدار را حاصل نمود تا نسل های آینده بتوانند از شرایط مناسب محیطی برخوردار شوند و از نعمتهای آن بهره جویند، با توجه به عوامل و متغیرهایی نظیر ویژگیهای خاص الگوی زراعی، تناوب زراعی،تقویم عملیاتهای زراعی، تقویم آبیاری محصولات مختلف رایج، طیف وسیع ترکیبات کشت نباتات زراعی، محدودیت زمین های قابل کشا و رقابت جدی محصولات در کسب آب مورد نیاز بهترین روشی که در برگیرنده اطلاعات فوق برای بررسی رفتارهای زارعین و ارائه راههای بهینه سازی این فعالیت ها می باشد (باقریان و همکاران،1386).

واژه میکوریز به معنی همزیستی بین قارچ و ریشه گیاه است، امروزه محققین و پژوهشگران توجه قابل ملاحظه ای به دلیل افزایش در رشد گیاهان، افزایش میزان محصول و استفاده از آن به عنوان کود بیولوژیک دارند، هیفهای قارچ میکوریز آربوسکولار با نفوذ به درون بافت میزبان در لایه کورتکس ریشه میزبان گسترش می یابند و مواد وورد نیاز خود را از گیاه جذب می کنند و در عوض با گسترش شبکه مسیلیومی خود در خاک جذب عناصری از قبیل کلسیم، سدیم، فسفر، نیتروژن، منیزیم، آهن، منگنز و کربن را در خاک افزایش می دهند و همچنین می توانند دامنه وسیعی از آنزیم های مستعد را برای تجربه ترکیبات آلی بوجود بیاورند(پفلگر و لیندرمن[3]،1994).

مهمترین عمل قارچ های میکوریز جذب فسفر از خاکهای با ذخایر فسفر کم می باشد که این انتقال با استفاده از انتقال فعال از قارچ به سلول میزبان صورت می گیرد، عوامل مختلفی از قبیل نوع خاک، مقدار و نوع مواد آلی خاک، مقدار رطوبت،نور و حرارت در شکل گیری رابطه میکوریزایی موثر می باشند(پفلگر و لیندرمن[4]،1994).

در نظام های پایدار، خاک به عنوان جزئی اساسی و حیاتی در نظر گرفته می شود و میکروارگانیسم های موجود در خاک در چرخه عناصر غذایی نقش بسزایی دارند، حضور این میکروارگانیسم ها خاک را پویا نگه داشته و این توانایی را برای پشتیبانی پایدار از زندگی گیاه بوجود می آورد، یکی از اصلی ترین میکروارگانیسم های موجود در محیط ریشه ،قارچ های میکوریز آربوسکلار هستند، این قارچ ها در تمام خاکها حضور دارند و با ریشه اکثر گیاهان رابطه همزیستی ایجاد می کنند ،83%گیاهان دو لپه ،79%گیاهان تک لپه و همه بازدانگان با قارچ های میکوریز دارای رابطه همزیستی هستند، روابط همزیستی میکوریزایی تحت واکنش های سه جانبه ای که بین گیاه میزبان ،قارچ میکوریز و شرایط خاک و محیط وجود دارد صورت می گیرد(تراپه[5]، 1987 سیوردینگ[6]،1991). مرفولوژی ریشه گیاهان بر ایجاد رابطه همزیستی میکوریزایی تاثیر دارد، به نظر بعضی از محققین پاسخ ضعیف گندمیان به قارچ های میکوریز به علفی بودن آنها ارتباط دارد، این گیاهان دارای سیستم های ریشه ای بسیار منشعبی بوده که بطور ضعیفی جهت جذب مواد غذایی به همزیستی میکوریزایی وابسته است، معلوم شده است که میکوریزی بودن گیاه با کمتر بودن تارهای کشنده ارتباط مستقیم دارد،معمولا ریشه های با آلودگی میکوریزایی زیاد دارای تراکم تارهای کشنده کمتری می باشند در حالیکه ریشه هایی با آلودگی کم تراکم تارهای کشنده زیادی دارند(غلامی و همکاران،1379).

یکی از کودهای با اهمیت در بخش مصرف در گیاهان هیومیک اسید می باشد ،هیومیک اسید یک پلیمر طبیعی است که دارای موضع های H+ مربوط به عامل های اسیدی کربوکسیل بنزوئیک و فنلی (مکان های تبادل کاتیونی) است(سردشتی و همکاران،1386).این اسید ماکرومولکول پیچیده آلی می باشد که با پدیده های شیمیایی و باکتریایی در خاک تشکیل می شود و نتیجه نهایی عمل هومیفیکا سیون است(سردشتی و همکاران،1386) . مواد آلی خاک تاثیر کنترل کننده ای بر باروری خاک دارد که بدون آن لایه سطحی زمین را به سختی می توان به عنوان خاک در نظر گرفت(هپکینس و استراک[7]،2003).اسید هیومیک و اسید فولویک از منابع مختلف نظیر خاک ،هوموس، پیت، لیگنیت اکسید شده، زغال سنگ استخراج می شود که در اندازه مولکولی و ساختار شیمیایی متفاوت اند(سردشتی و همکاران،1386).

اسید هیومیک در اثر تجزیه مواد آلی به ویژه مواد با منشا گیاهی بوجود می آید و در خاک، زغال سنگ و پیت یافت می شود و با وزن مولکولی 300000-30000 سبب تشکیل کمپلکس پایدار و نامحلول با عناصر میکرو می گردد(مکوئیک و همکاران[8]،2001). کاربرد اسید هیومیک در گیاه بصورت محلول پاشی و خاکی موجب افزایش هورمون های اکسین، سیتوکنین و جیبرلین در گیاه می شود (عبدل ماوگواد و همکاران[9]،2007).اسید هیومیک از طریق افزایش رشد گیاه به خصوص ریشه ها، میزان فتوسنتز، جذب عناصر غذایی، سطح برگ، بیوماس گیاهی و نفوذ پذیری بافت های گیاهی می شود(چن و اوید[10]،1990). کاربرد اسید هیومیک به صورت محلول پاشی و کاربرد در خاک و کارایی عناصر غذایی در گیاه می شود(ادنی و همکاران[11]،1998).

مقادیر بسیار کم از اسید های آلی به دلیل وجود ترکیبات هورمونی اثرات مفیدی در افزایش تولید و کیفیت محصولات کشاورزی دارند(سماوات و ملکوتی[12]،2005). همچنین اسید هیومیک با افزایش فعالیت آنزیم روبیسکو سبب افزایش فعالیت فتوسنتزی گیاه می شود(دلفین و همکاران[13]،2005). سبزواری و همکاران (1388) در تحقیقی عنوان نمودند که با توجه ملاحظات زیست محیطی اخیرا استفاده از انواع اسیدهای آلی برای بهبود کمی و کیفی محصولات زراعی و باغی رواج فراوان یافت است، مقادیر بسیار کم از اسیدهای آلی اثرات قابل ملاحظه ای در بهبود خصوصیات فیزیکی ،شیمیایی و بیولوژیکی خاک داشته و به دلیل وجود ترکیبات هورمونی اثرات مفیدی در افزایش تولید و بهبود کیفیت محصولات کشاورزی دارند.

2-5- بررسی و ارزیابی ارقام پسته. 51

2-6- ارزیابی و اصلاح پایه های پسته. 61

2-7- استفاده از بیوتكنولوژی در شناسایی، تكثیر و اصلاح ارقام و پایه های پسته. 71

ب – استفاده از بیوتكنولوژی در تكثیر ارقام و پایه های پسته. 82

پ – استفاده از بیوتكنولوژی در اصلاح ارقام و پایه های پسته. 87

فصل 3. 89

مواد و روشها 89

زمان و موقعیت جغرافیایی محل انجام آزمایش: 90

مشخصات اقلیمی و جغرافیایی محل تحقیق: 90

رسم نقشه ونقاط پراکنش: 90

کدهای قرار دادی برای ژنوتیپ های نروماده: 90

نقشه باغ کلکسیون تلقیح کنندگان پسته بلوک 3و4. 93

نقشه باغ كلكسیون پایه های بذری (Seedling) پسته ایستگاه تحقیقات پسته دامغان. 95

3-1)اندازه گیری صفات کمی وکیفی ژنوتیپ های نر: 98

3-1-1)ابعاد جوانه گل.. 98

3-1-2)صفات باز شدن گل: 98

3-1-3)اندازه گیری طول محور گل آذین: 98

3-1-4 )اندازه گیری طول شاخه سال جاری: 99

3-1-5)تعیین درصد جوانه زنی دانه گرده: 99

تهیه نمونه. 99

تهیه محیط کشت: 99

تعیین درصد قوه نامیه با استفاده از تست IKI: 100

3-1-6) اندازه گیری میزان فلورسنس كلروفیل: 100

روش کار دستگاه کلروفیل فلرومتر: 100

3-1-7 ) اندازه گیری میزان فتوسنتز با دستگاه فتوسنتز آنالایزر: 101

3-1-9) اندازه گیری مقدار کلرفیل: 102

3-1-10 ) اندازه گیری صفات ژنوتیپ های ماده: 102

3-1-10-1 )اندازه گیری میزان فلورسنس كلروفیل: 102

3-1-11) اندازه گیری صفات كمی وكیفی مربوط به خوشه : 103

3-1-12 )اندازه گیری صفات كمی وكیفی مربوط به میوه: 103

روش تجزیه تحلیل داده ها: 104

فصل 4. 105

نتایج و بحث… 105

4-نتایج: 106

4-1-ژنوتیپ های نر. 106

4-1-1-نتایج ارزیابی صفات گلدهی.. 106

4-1-1-3-نتایج ارزیابی همپوشانی ژنوتیپهای انتخابی با 9رقم تجاری.. 107

4-1-1-5-نتایج بررسی اثر ژنوتیپ بر جوانه زنی دانه گرده 109

4-1-1-6-نتایج بررسی اثر ژنوتیپ بر قوه نامیه دانه گرده 110

4-1-2-اثر ژنوتیپ های مختلف بر روی سطح برگ… 112

4-1-3-نتایج بررسی اثر ژنوتیپ برروی طول محور گل آذین در ژنوتیپ های نر. 113

4-1-4-نتایج بررسی اثر ژنوتیپ برروی طول شاخه سال جاری در ژنوتیپ های نر. 114

4-1-5- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ برروی طول جوانه گل در ژنوتیپ های نر. 115

4-1-6- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ های مختلف برروی قطر جوانه گل در ژنوتیپ های نر. 116

4-1-7- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ برروی فلورسنس حداقل(FO) در ژنوتیپ های نر. 117

4-1-8- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ برروی فلورسنس متغیر(FV) در ژنوتیپ های نر. 118

4-1-9- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ برروی میزان فلورسنس ماکزیمم(FM) در ژنوتیپ های نر. 119

4-1-10- نتایج بررسی نسبت فلور سنس متغیر به ماکزیمم(FM/FV) در ژنوتیپ های نر. 120

4-1-11- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ برروی میزان سرعت فتوسنتز در ژنوتیپ های نر. 122

4-1-12- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ برروی میزان تعرق در ژنوتیپ های نر. 123

4-1-13- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ برروی دمای برگ در ژنوتیپ های نر. 124

4-1-14- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ برروی میزان کلروفیلA در ژنوتیپ های نر. 125

4-1-15- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ برروی میزان کلروفیلB در ژنوتیپ های نر. 126

4-1-16- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ برروی میزان کلروفیل کل در ژنوتیپ های نر. 127

4-2- نتایج آنالیز صفات کمی وکیفی 20 ژنوتیپ ماده 129

4-2-1-نتایج بررسی اثر ژنوتیپ برروی سطح برگ در ژنوتیپ های ماده 129

4-2-2-نتایج بررسی اثر ژنوتیپ برروی طول شاخه سال جاری در ژنوتیپ های ماده 130

4-2-3- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ برروی فلورسنس حداقل(FO) در ژنوتیپ های ماده 131

4-2-4- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ بر میزان فلورسنس ماکزیمم(FM) در ژنوتیپ های ماده 132

4-2-5- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ برروی فلورسنس متغیر(FV) در ژنوتیپ های نر. 133

4-2-6- نتایج بررسی نسبت فلور سنس متغیر به ماکزیمم(M/FV) در ژنوتیپ های ماده 134

4-2- 7نتایج بررسی اثر ژنوتیپ برروی میزان سرعت فتوسنتز در ژنوتیپ های ماده 136

4-2-8- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ برروی میزان تعرق در ژنوتیپ های ماده مختلف… 137

4-2-9- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ های ماده مختلف برروی دمای برگ… 138

4-2-10- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ های ماده مختلف برروی درصد پوکی میوه پسته. 139

4-2-11- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ های ماده مختلف برروی وزن خشک میوه پسته. 140

4-2-12- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ های ماده مختلف برروی مقدار انس میوه پسته. 142

4-2-13- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ های ماده مختلف برروی درصدخندانی میوه پسته. 143

4-2-14- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ های ماده مختلف برروی وزن پوست تر میوه پسته. 145

4-2-15- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ های ماده مختلف برروی وزن تر100عدد میوه پسته. 146

4-2-15- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ های ماده مختلف برروی شکاف نا منظم میوه پسته. 147

4-2-15- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ های ماده مختلف بر زود خندانی( شکاف منظم میوه )پسته. 148

4-2-16- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ های ماده مختلف برروی طول خوشه پسته. 150

4-2-17- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ های ماده مختلف برروی عرض خوشه پسته پسته. 151

4-2-18- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ های ماده مختلف برروی قطر دم خوشه پسته. 152

4-2-19- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ های ماده مختلف برروی تعداد پسته در خوشه. 153

4-2-20- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ های ماده مختلف برروی تعداد انشعابات اولیه خوشه پسته. 154

-2-20- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ های ماده مختلف برروی تعداد انشعابات ثانویه خوشه پسته. 155

4-2-21- نتایج بررسی اثر ژنوتیپ های ماده مختلف برروی وزن خوشه پسته. 156

نتیجه گیری کلی: 160

توصیه ها: 166

پیشنهادات: 167

منابع: 169

چکیده

پسته یکی از مهمترین اقلام باغی کشور و از عمده ترین محصولات صادراتی غیر نفتی می باشد. شهرستان دامغان یکی از شهرستانهای استان سمنان به عنوان از مناطق مستعد پسته کاری کشور محسوب می شود. این تحقیق در ایستگاه تحقیقات پسته دامغان در سالهای 93-92به منظور بررسی صفات کمی وکیفی ژنوتیپ های پسته انجام گردید. برای انجام این آزمایش تعداد20 ژنوتیپ نر و20 ژنوتیپ ماده از بین درختان کلکسیون پایه مادری (بذری) وکلکسیون تلقیح کنندگان پسته انتخاب گردیدو در ژنوتیپهای نر کلیه صفات گلدهی،زمان ،طول دوره گلدهی ، همپوشانی با ارقام ماده ابعاد جوانه گل، طول محور گل آذین، درصد جوانه زنی و قوه نامیه ژنوتیپهابا تست IKI ،سطح برگ ،طول شاخه . میزان فلورسنس كلروفیل میزان فتوسنتز، دمای برگ، ، میزان و شدت تعرق ، کلروفیل ، اندازه گیری شد.در ژنوتیپهای ماده صفات سطح برگ ،طول شاخه . میزان فلورسنس كلروفیل میزان فتوسنتز، دمای برگ، ، میزان و شدت تعرق ، صفات کمی وکیفی مربوط به خوشه و میوه اندازه گیری شد. مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نتایج نشان داد با توجه به تجزیه واریانس داده ها وآزمون دانکن در ژنوتیپ های نرکلیه صفات معنی دار بود.در ژنوتیپ های ماده در اکثر صفات معنی دار گردید. با توجه به نتایج بدست آمده در ژنوتیپ های نردر صفات گلدهی وهمپوشانی ژنوتیپ های شما 14و19و صفات مر فولوژیک گل وکلروفیل برگ ژنوتیپ شماره 7 و میزان فلورسنس كلروفیل ژنوتیپ شماره 9 وصفات فتوسنتزی ژنوتیپ شماره1 بعنوان ژنوتیپ های مطلوب شنا سایی وثبت گردید. و در ژنوتیپ های ماده در میزان فلورسنس كلروفیل ژنوتیپ شماره 17 وصفات فتوسنتزی و صفات مربوط به خوشه وعملکرد ژنوتیپ شماره6 ودر صفات میوه وزن خشک و انس بهترین عملکرد ژنوتیپ شماره 17ومیزان خندانی ژنوتیپ شماره 2 بعنوان ژنوتیپ های مطلوب شنا سایی وثبت گردید. که میتوان باتحقیقات بیشتر بعنوان رقم معرفی نمود.

واژهای کلیدی:پسته، ژنوتیپ،صفات،فلورسنس کلروفیل،فتوسنتز،جوانه زنی،قوه نامیه، تست IKI

مقدمه:

اهمیت اقتصادی پسته معروف به طلای سبز، بر هیچ كس پوشیده نیست. پسته به عنوان یك محصول استراتژیك جایگاه خاصی در بین تولیدات كشاورزی ایران دارد. این محصول بخش عمده ای از صادرات غیر نفتی در حدود 55 درصد از تولید و بیش از 60 درصد از صادرات جهانی را به خود اختصاص داده است. در آمد ارزی حاصل از صادرت پسته در ایران به بیش از 1000 میلیون دلار میرسد. عدم تلقیح به موقع ارقام مختلف پسته وعدم هم پوشانی گلهای نر وماده پسته به علت نبود رقم مناسب بامنطقه جغرافیایی ونیز معرفی تعداد انگشت شماری ازارقام تجاری ما را به این فکر وامیدارد که با بررسی ژنوتیپ های مختلف که درطبیعت بصورت بذری وجود داردژنوتیپ های مناسب آن منطقه را بیابیم و با عملیات بهنژادی واصلاح و معرفی آن گامی هر چند کوچک در جهت پیش برد اهداف تحقیقات و سند راهبردی پسته برداریم و امیدواریم این بزرگترین محصول صادراتی کشور همچنان در بازار های خارجی بی رقیب باقی بماند.

انتخاب ارقام و پایه های مناسب برای هر منطقه از جمله عواملی است كه بر روی میزان تولید و كیفیت محصول تولیدی موثر می باشد و این مسئله می تواند اقتصادی بودن یا غیراقتصادی بودن كشت و تولید پسته را در یك منطقه توجیه نماید. بنابراین بایستی در هر منطقه بر اساس شرایط آب و هوایی موجود همچون میزان درجه حرارت در فصل رشد، احتمال بروز سرمای بهاره و پاییزه، میزان بارندگی و … رقم مناسب را انتخاب و توسعه داد.

ارقام تجاری موجود بطور تصادفی در اثر تفرقه صفات ناشی از كشت بذری بوجود آمده اند . با توجه به هتروزیگوتی شدید پسته، نتایج حاصل از كشت بذور مختلف حتی یك درخت دارای صفات و خصوصیات بسیار متفاوتی هستند. بنابراین با توجه بذری بودن باغات قدیمی پسته، سابقه و قدمت كاشت پسته در ایران، بسیار متنوع ارقام و فنوتیپهای موجود پسته ایران درجهان بی نظیر است . ارقام پسته تجاری موجود در ایران بدون كار اصلاحی ایجاد شده اند و توسط باغداران علاقه مند، در سطح محدودی از تنوع ژنتیكی انتخاب و تكثیر شده اند. مسلم است در صورت بررسی و شناسایی ارقام و فنوتیپها پتانسیل افزایش تولید پسته از لحاظ خصوصیات كمی و كیفی بر تر نسبت به ارقام موجود وجود دارد

ارقام عمده تجارتی پسته دارای عیوبی نظیر حساسیت به خطر سرمازدگی (رقم كله قوچی ) ، كم بودن كمیت و كیفیت پسته (اوحدی)، دیر گلی، عدم تلقیح كافی، خطر گرمازدگی در زمان گلدهی و عدم تامین نیاز سرمایی (اكبری)، سال آوری شدید و آلودگی به افلاتوكسین (احمد آقایی) می باشند .بنابراین هر ساله قسمتی از محصول در اثر خصوصیات فنولوژیكی و فیزیولوژیكی این ارقام و نیز عدم مطابقت كامل با شرایط اقلیمی از بین می رود.

در مناطق پسته کاری استان سمنان خصوصا دامغان با سطح زیر کشت باغ بر 14700هکتاربزرگترین محصول باغبانی استان محسوب می شودکه به توجه بیشتری از طرف بخصوص دانشگاهیان نیاز دارد. همچنین برداشت های غلط روستائیان بعلت ضعف واز هم گسیختگی زنجیره تحقیق آموزش وترویج ما را برآن داشت که دراین تحقیق با بررسی صفات کمی وکیفی 20 ژنوتیپ گرده زا 20 ژنوتیپ ماده که در باغ کلکسیون ایستگاه تحقیقات پسته دامغان انتخاب و مورد بررسی قرار می دهیم وشاخص های مختلف از جمله شروع واتمام گلدهی طول دوره گلدهی درصد جوانه زنی در روز های مختلف وصفات دیگر مورد بررسی قرار می گیرد تاارقام مناسب وجدیدی برای کاشت درمناطق پسته کاری شناساییو و معرفی گردد. تنكی خوشه های پسته و عدم دانه بندی مناسب پسته در مناطق پسته كاری دامغان به علت عدم تلقیح وتلقیح نا مناسب و وجود تعداد انگشت شماری فنوتیپ های ماده تجاری و عدم تناسب آنها با شرایط تنش های محیطی وکمبود آب از اساسی ترین مشكلات این منطقه می باشد. یك از فرضیه بر این است كه می توان با انجام عملیات بهنژادی ومعرفی رقم جدید بر میزان عملکرد پسته تاثیر گذاشت. حدود 50 ژنوتیپ نر و 750 ژنوتیپ ماده بذری در كلكسیون ایستگاه تحقیقات پسته وجود دارد كه تا كنون تحقیق جامعی بر روی این موضوع انجام نشده است كه در این تحقیق به این مهم پرداخته می شود.

2-8-2-2- واریته های سرولوژیكی سازگار با میزبان………………………………………………………………………32

3-8-2-2- واریته های سرولوژیكی ناسازگار…………………………………………………………………………………33

3-2- شاخص­های بیماری­زایی……………………………………………………………………………………………………..33

1-3-2- آنتی­ژن­های سطحی………………………………………………………………………………………………………..33

2-3-2-تهاجم…………………………………………………………………………………………………………………………….33

3-3-2- اندو­توكسین انترو­توكسین سیتو­توكسین …………………………………………………………………………….34

4-2- بیماری­زایی و مكانیسم آن……………………………………………………………………………………………………34

1-4-2- روند بیماری­زایی……………………………………………………………………………………………………………35

2-4-2- میزان شیوع سالمونلوز در انسان……………………………………………………………………………………….35

3-4-2- عفونت­های سالمونلایی در انسان……………………………………………………………………………………..36

1-3-4-2- تب تیفوئید و تب­های روده­ای……………………………………………………………………………………..36

2-3-4-2- سپتی­سمی…………………………………………………………………………………………………………………37

3-3-4-2- گاسترو­انتریت…………………………………………………………………………………………………………….37

4-4-2- علائم بالینی در انسان……………………………………………………………………………………………………..37

5-2- اپیدمیولوژی……………………………………………………………………………………………………………………….38

6-2- روش­های تشخیص…………………………………………………………………………………………………………….40

1-6-2- روش­های فنوتیپی…………………………………………………………………………………………………………..41

1-1-6-2- بیوتایپینگ………………………………………………………………………………………………………………..41

2-1-6-2- سروتایپینگ……………………………………………………………………………………………………………….42

3-1-6-2- روش­های ایمنولوژیك………………………………………………………………………………………………..42

1-3-1-6-2- الایزا…………………………………………………………………………………………………………………….43

2-3-1-6-2- IMS…………………………………………………………………………………………………………………..44

2-6-2- روش­های ژنوتیپی………………………………………………………………………………………………………….44

1-2-6-2- روش واكنش زنجیره ایی پلیمراز PCR)) …………………………………………………………………. 45

2-2-6-2- multiplex PCR……………………………………………………………………………………………………47

3-2-6-2- real-time PCR……………………………………………………………………………………………..47

4-2-6-2- روش تکثیر هم دمای وابسته به حلقه LAMP………………………………………………………………48

1-4-2-6-2- پرایمرهای LAMP………………………………………………………………………………………………..49

2-4-2-6-2- مكانیسم واكنش LAMP……………………………………………………………………………………….51

3-4-2-6-2- مشخصات روش LAMP………………………………………………………………………………………56

4-4-2-6-2- مواد لازم برای انجام واکنش LAMP………………………………………………………………………57

5-4-2-6-2- ارزیابی محصولات LAMP……………………………………………………………………………………60

6-4-2-6-2- مكانیسم تشكیل كدورت در واكنش LAMP…………………………………………………………….61

7-4-2-6-2- مزایای روش LAMP…………………………………………………………………………………………….62

7-2 مطالعات آزمایشگاهی…………………………………………………………………………………………………………….63

1-7-2- مطالعه بر روی سویه­هایسالمونلابه روش الایزا……………………………………………………………….63

2-7-2- مطالعه بر روی سویه­هایسالمونلابه روش PCR………………………………………………………………65

3-7-2- مطالعه بر روی سویه­های سالمونلا به روش LAMP…………………………………………………………..70

فصل سوم (مواد و روش ها)…………………………………………………………………………………………………………75

1-3 وسایل مورد استفاده………………………………………………………………………………………………………………76

2-3- مواد مورد استفاده ………………………………………………………………………………………………………………77

3-3- رنگ آمیزی گرم………………………………………………………………………………………………………………..79

4-3- تستهای بیوشیمیایی……………………………………………………………………………………………………………79

1-4-3- تست سیمون سیترات…………………………………………………………………………………………………….81

2-4-3- تست تریپل شوگر ایرون آگار(TSI) ………………………………………………………………………………81

3-4-3- تست SIM…………………………………………………………………………………………………………………82

4-4-3- تست اوره …………………………………………………………………………………………………………………..82

5-3- روش تهیۀ گلسیرول استوک از باکتری­ مورد نظر…………………………………………………………………..83

6-3- روش استخراج DNA ……………………………………………………………………………………………………..83

1-6-3- طرز تهیۀ محلول­های مورد نیاز برای استخراج DNA………………………………………………………..84

2-6-3- مراحل استخراج DNA …………………………………………………………………………………………………84

7-3- تعیین غلظت DNA با دستگاه اسپکتروفتومتر……………………………………………………………………….86

8-3- الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………..87

1-8-3- طرز تهیه ژل آگارز…………………………………………………………………………………………………………88

2-8-3- طرز تهیۀ بافر (1X)TBE……………………………………………………………………………………………….88

9-3- واکنش PCR ……………………………………………………………………………………………………………………89

1-9-3- اجزا واکنش PCR………………………………………………………………………………………………………….91

2-9-3- روش انجام واکنش PCR با آنزیم SmarTaq DNA Polymerase……………………………….93

10-3- واکنش LAMP………………………………………………………………………………………………………………94

1-10-3- روش انجام واکنشLAMP …………………………………………………………………………………………95

11-3- آلوده سازی سس مایونز با باكتری مورد نظر………………………………………………………………………..96

12-3- آلوده سازی سالاد سبزیجات با باكتری مورد نظر…………………………………………………………………..97

13-3- تهیه پورپلیت و شمارش باكتری­ها………………………………………………………………………………………98

1-13-3 تهیه رقت……………………………………………………………………………………………………………………..98

2-14-3- کشت سطحی………………………………………………………………………………………………………………99

2-14-3- کشت پورپلیت…………………………………………………………………………………………………………….99

3-13-3 شمارش باكتری­ها…………………………………………………………………………………………………………..99

فصل چهارم (نتایج)……………………………………………………………………………………………………………………100

1-4- رنگ آمیزی گرم از باكتری……………………………………………………………………………………………….101

2-4- نتایج کشت نمونه ها روی محیط اختصاصیshigella–salmonellaagar………………………101

2-4- تست­های بیوشیمیایی……………………………………………………………………………………………………..102

1-3-4- تست اوره………………………………………………………………………………………………………………….102

2-3-4- تست سیمون سیترات…………………………………………………………………………………………………..103

3-3-4 تست TSI ……………………………………………………………………………………………………………………104

4-3-4 تست SIM……………………………………………………………………………………………………………………105

5-3-4 تست متیل رد ……………………………………………………………………………………………………………….106

4-4- استخراج DNA …………………………………………………………………………………………………………….107

5-4- PCR………………………………………………………………………………………………………………………………108

1-5-4- حد تشخیص PCR………………………………………………………………………………………………………109

6-4- LAMP ……………………………………………………………………………………………………………………….110

1-6-4 حد تشخیص LAMP………………………………………………………………………………………………….112

فصل پنجم (بحث)……………………………………………………………………………………………………………………113

نتیجه­گیری………………………………………………………………………………………………………………………………..121

منابع و ماخذ……………………………………………………………………………………………………………………………..122

چكیده

سالمونلاباكتری گرم منفی، متحرك و باسیلی شكل است كه خصوصیات عمومی خانوادهانتروباكتریاسهرا دارا می باشد.سالمونلاو سروتیپ های آن منبع مهم آلودگی غذاهای انسانی و عامل پاتوژن بسیار قوی و بیماری­زا در انسان­هاست. امروزه بیش از 2450 سروتیپسالمونلاشناسایی شده است كه برخی از این سروتیپ ها عامل بیماری هایی از قبیل تب تیفوئید و انتروكولیك در انسان می باشند. بیماری­های ناشی از این عامل یک معضل بزرگ بهداشتی در جهان به خصوص در کشورهای در حال توسعه از جمله کشور ما می باشد. بنابراین تشخیص سریع، دقیق و به موقع آن برای جلوگیری از اپیدمی و عوارض مخرب این باکتری ضروری به­نظر می­رسد.

روش­های مختلفی برای جداسازی باكتریسالمونلااز نمونه های محیطی وجود دارد كه شامل: روش های كشت سنتی و بیوشیمیایی، سرولوژیكی و مولكولی (از جمله PCR) است. تمام این روش­ها به زمان طولانی، تعداد زیاد باکتری در نمونه اولیه، تجهیزات گران­قیمت آزمایشگاهی و به افراد متخصص در این زمینه نیاز دارند.

هدف از این مطالعه بررسی کارایی روش نوین تشخیص مولکولی LAMP در تشخیص عامل عفونیسالمونلاتیفیمی­باشد. بررسی نتایج در تشخیص مولکولیسالمونلاهانشان داد که روش LAMP روشی سریع، ارزان و اختصاصی است و به­جای دستگاه­های گران­قیمت PCR و برنامه چرخه حرارتی چند دمایی آن با استفاده از یک بلوك حرارتی بسیار ساده و ارزان و در یک دمای واحد 60 درجه سانتی­گراد و همچنین مشاهده کدورت حاصل از فرایند تکثیر ژن­ها در زمان كوتاه­تری به تشخیص اختصاصی این باكتریسالمونلاپرداخت.

این روش می تواند جهت تشخیص مولکولی سریع، دقیق و ارزان با كاربرد گسترده در آزمایشگاه­های تشخیصی و بخصوص تشخیص عوامل عفونی در آزمایشگاه­های مناطق محروم و آزمایشگاه­های سیار مورد استفاده قرار گیرد.

واژه های کلیدی :سالمونلا، تشخیص مولکولی، PCR، LAMP

مقدمه

اعضای جنسسالمونلا، باكتری گرم منفی، میله­ایی، بی­هوازی اختیاری و بدون اسپور هستند. از آنجا كه جایگاه اصلی و طبیعی این باكتری ها روده انسان و حیوانات می باشد اصطلاحاً آنها را باسیل های روده ای یا انتریك می نامند. از لحاظ شرایط رشد این میكروارگانیسم ها باكتری های انعطاف پذیری بوده و به آسانی با شرایط محیطی خود را هماهنگ می كنند این جنس از میكروارگانیسم ها به حرارت حساس اند. در درجه حرارت های پائین امكان بقای آنها بیشتر است .(Connie & Manuselis, 2000)

اكثر سروتیپ هایسالمونلاپاتوژن های بالقوه برای انسان و بسیاری از حیوانات می باشند. این باكتری ها در دستگاه گوارش مهره داران اعم از پستانداران و پرندگان و خزندگان و ماهی ها سیطره پیدا كرده، بسته به سروتیپ، شرایط و عوامل متعدد میزبانی، بیماری­هایی با نشانه های گوناگون و عوارض متفاوت ایجاد می كنند .(Merchant & Pocker, 1983)از جمله باكتری­های روده­ایی­ هستند كه موجب بیماری تب تیفوئید(حصبه)، تب شبه حصبه و بیماری­های ناشی از مواد غذائی در انسان می­گردند(Jayet al., 2005).

بیماری­های ناشی از آلودگی مواد غذائی ناشی ازسالمونلارا non typhoidal نامیده­اند.سالمونلابه­طور گسترده­­ایی در محیط زیست از قبیل آب، خاك و مدفوع حیوانات توزیع شده است (Cidrp, 2009). باكتری معمولاً از طریق مدفوع انسان و یا دام دفع شده و باعث آلودگی آب و غذا و محیط می گردد. مواد غذائی مانند گوشت، تخم­مرغ، مرغ، سس مایونز، سبزیجات و غیره ،از ناقل­های اولیه عفونتسالمونلابه انسان هستند(Dolye & Beuchat, 2007)..

سالمونلای غیر­تیفوئیدی علت اصلی بیماری­های ناشی از مواد غذائی در سراسر جهان است. كه بر­آورد شده كه حدود 4/1 میلیون مورد در سال مورد عفونت غذائیسالمونلاقرار می­گیرند(Meadet al., 1999).

از این­رو شناخت و تشخیص به موقعسالمونلااز اهمیت خاصی برخوردار است. با ذكر تمامی این موارد به نظر می رسد تشخیص به موقع و كنترل باكتری از وظایف مهم آزمایشگاه های میكروب شناسی است. امروزه از 3 روش رایج به تشخیص باكتری می پردازند:

ـ روش های كشت سنتی و آزمایشات بیوشیمیایی.

ـ روش های سرولوژیكی.

ـ روش های مولكولی.

برای تشخیص استفاده از روش­های سنتی مبتنی بر محیط كشت قابل قبول است ولی وقت­گیر است و برای تایید جواب نهایی چند روز به­طول می­انجامد .(Andrews & Hammack, 2007) علاوه­بر این، روش­های ایمنولوژیك مانند الایزا وIMS نیز برای شناسائیسالمونلاتوسه یافته­اند.

. (Mansfield & Forsythe, 2000 ; FAVRIN , 2001) با این­حال اختصایت كم و هزینه­های بالا، استفاده ازین روش­ها را محدود كرده است. اخیرا روش­های مولكولی مانند PCR و real time PCR به­طور گسترده در شناسائیسالمونلااستفاده می­شوند كه روش­هایی كارآمد و حساس هستند.

Krascsenicsovaet al., 2008) ; Eriksson & Aspan, 2007).

با این­حال این روش­ها نیازمند سیكل حرارتی اختصاصی و دستگاه­های گران­قیمت­اند. از­این­رو نیاز به یك روش دقیق، حساس، آسان و به­صرفه­تر است. در سال 200 یك گروه ژاپنی یك روش تشخیص مولكولی به نام LAMP را معرفی كردند .(Notomiet al., 2000)از آن زمان روش LAMP به عنوان یك روش اختصاصی، حساس و سریع برای شناسائی پاتوژن­های ناشی از مواد غذائی مورد استفاده است. یك روش ساده، بدون نیاز به سیكل حرارتی اختصاصی و دستگاه­های گران­قیمت و به آسانی قابل اجرا است(Hara-Kudoet al., 2005; Notomiet al., 2000).

هدف این تحقیق شناسائی باكتریسالمونلا تیفیدر سالاد سبزیجات و سس مایونز آلوده با استفاده از روش LAMP، به­عنوان روشی سریع، حساس و اختصاصی می­باشد.

اهداف تحقیق در نگاه اجمالی

1. طراحی و بهینه­سازی روش LAMP بر اساس ژن تهاجمی invAسالمونلا تیفی

1. تعیین حد حساسیت روش PCR و LAMP به روی ژن تهاجمی invAسالمونلا تیفی

1. مقایسه دو روش PCR و LAM

• مشخصات جنسسالمونلا

1-1-2- تاریخچه

در سال 1885 یك دامپزشك آمریكائی به نام دانیل المر سالمون برای اولین بار این باكتری را از خوك جدا كرد وآن راباسیلوس كلرا­سوئیس[1] نامید. در سال 1888 جرم دیگری توسط گارتنر از فردی كه در اثر گاستروانتریت ناشی از مصرف گوشت نپخته مرده بود جدا شد و آن­راباسیلوس انتریتیدیسنامید كه بعداًسالمونلا انتریتیدیسخوانده شد. در سال 1900 خواص این باكتری توسط فردی به نام لینیر به­طور رسمی تصویب گردید. از آنجا كه این ارگانیسم ها شبیه به باكتری های جدا شده توسط سالمون بودند، به همین جهت به افتخار كاشف اولیه این باكتریسالمونلا[2] نامیدند(Roumagnac et al., 2006).

در فاصله بین سال­های 1925ـ1900 بزرگ­ترین رویداد در كشف سرولوژیكی آنتی ژن های سوماتیك و فلاژلا در مورد گروهسالمونلابوسیله لیگنیرز انجام شد. در سال 1926 تركیبات پادگنیسالمونلاطبقه بندی گردید و جدولی به نام جدول كافمن ـ وایت ایجاد شد. در حال حاضر این جدول دارای حدود 2500 سروتیپ است (Bhatia & Nabb , 1980) .

سالمونلابطور گسترده در طبیعت توزیع شده است مانند آب آلوده، خاك حاوی مدفوع حیوانات و غیره.بهطورعمده این باكتری­ها در روده­ی حیوانات ساكن است و مخزن اصلی آلودگی مرغ، تخم مرغ، دام، حیوانات خانگی و خزندگان است(Cidrp, 2009).

2-1-2- خواص شكلی

اعضای جنسسالمونلاباكتری­های میله­ای شكل و اندازه­ی آن 5-2 ´5/1-7 /. میكرون بوده است.گرم منفی، بدون اسپور و متعلق به خانواده­ی انتروباكتریاسه­اند (J. Antonio , 2009 ; Dolye & Beuchat, 2007) .. اكثر اعضای این جنس متحرك و با تاژه­ی پری­تریش­اند به­جز چند مورد استثناء مانندسالمونلا گالیناروم[3] وسالمونلا پولوروم[4] (et al., 2005 Hara-Kudo).

3-1-2- خواص بیوشیمیایی

اعضای این جنس قادر به تخمیر گلوكز بوده ولی از تخمیر ساكارز و لاكتوز نا­توانند. بیشتر انواعسالمونلاها گلوكز، مالتوز، مانیتول، دولسیتول، دكسترین و سوربیتول را تخمیر می كنند و اسید و گاز بوجود می آورند. اكثر سویه­ها H₂sرا از منبع سولفوری معدنی تولید كرده و تولید H₂S یکی از واکنش های کلیدی در تشخیصسالمونلاها می­باشد. به استثنای سروتیپتیفی[5] در بیشتر موارد جدا شده از گلوکز گاز ایجاد می­کنند. در سیترات به عنوان تنها منبع كربن رشد می­كنند اما برخی از گونه ها مانندسالمونلاتیفیوسالمونلاپاراتیفیAسیترات منفی هستند Aksoy, 2004)). این باكتری اكسیداز منفی و كاتالاز مثبت بوده. از تولیدات این باكتری لیزین در كربوكسیلات، سولفات هیدروژن وارنیتین می باشد.

( Alcamo , 1997 ; Connie & Manuselis, 2000) .

از دیگر ویژگیهای بیوشیمیایی این است كه اكثرسالمونلاها عدم تولید اندول، عدم تولید آنزیم های اوره آز، لیپاز، دزاكسی ریبونوكلئاز، فنیل آلانین و تریپتوفان دآمیناز، دكربوكسیلاسیون اسیدهای آمینه لیزین، اورنیتین و آرژنین، واكنش مثبت در آزمایش متیل رد(MR) و واكنش منفی در آزمایش وژس ـ پروسكوئر (VP) مثبت می باشد.( (Alcamo , 1997 ; Dolye & Beuchat , 2007.

4-1-2- مقاومت در برابر عوامل فیزیكی و شیمیایی

این باكتری روی محیط كشت ماهها زنده می­مانند. حرارت 60 درجه را 15 تا 20 دقیقه تحمل می­كنند،سالمونلاها مدت 13 ماه در لاشه­های آلوده نگهداری شده در یخچال، 120 روز درآب، 280 روز در خاك باغچه و مدت بسیار طولانی در شیرخشك­های بدون چربی و موادغذایی دارای تخم مرغ زنده می­مانند. سالمونلاها نسبت به سرما مقاوم بوده و مدت3 ماه در برف و یخ زنده مانده واز این طریق می­توانند اپیدمی به­وجود آورند. كلرامنفیكل استرپتومیسین و بسیاری از آنتی بیوتیك های وسیع الطیف بر آن موثرند پنی سیلین بر آن كاملا بی­اثر است.سالمونلاها همچنین نسبت به املاح صفراوی مقاومند وبه همین دلیل از این مواد نیز علاوه بر رنگ­ها در تهیه محیط های غنی كننده استفاده می كنند Aksoy, 2004)).

5-1-2- خواص كشت