1-12-4- گل …………………………………………………………………………………………………………………. 22

1-12-5- غلاف ……………………………………………………………………………………………………………… 22

1-12-6- بذر ………………………………………………………………………………………………………………….. 23

1-13- جوانه زنی …………………………………………………………………………………………………………… 23

1-14- سطح زیر کشت و عملکرد گیاه مورد بررسی …………………………………………… 23

فصل دوم:ی بر تحقیقات انجام شده

2-1- نشانگرها ………………………………………………………………………………………………………………… 25

2-2- انواع نشانگر …………………………………………………………………………………………………………… 25

2-2-1- نشانگر RAPD …………………………………………………………………………………………….. 25

2-2-2- نشانگر RFLP ………………………………………………………………………………………………. 27

2-2-3- نشانگر AFLP ………………………………………………………………………………………………. 28

2-2-4- نشانگر SSR ………………………………………………………………………………………………….. 30

2-2-4- نشانگر 31

2-2-4-2- نقشه یابی ژنوم ………………………………………………………………………………………….. 32

2-2-4-3- برچسب زنی ژن و گزینش به کمک مارکر ……………………………………….. 32

2-2-4-4- تنوع ژنتیکی و آنالیز فیلوژنتیکی …………………………………………………………… 33

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1- تجهیزات و مواد موردنیاز جهت آزمون شیمیایی، میکروبی و PCR …….. 36

3-1-1- تجهیزات مورد استفاده ………………………………………………………………………………… 36

3-1-2- مواد مورد استفاده …………………………………………………………………………………………. 37

3-1-3- بافرها و محلول ها …………………………………………………………………………………………. 38

3-1-3-1- بافر TBE (TRIS-Boric acid- EDTA) ……………………………….. 38

3-1-3-2- محلول EDTA ………………………………………………………………………………………. 39

3-1-3-3- NaOH ……………………………………………………………………………………………………… 39

3-1-3-4- CTAB BUFFER…………………………………………………………………………….. 39

3-2- خصوصیات مکان آموزشی ……………………………………………………………………………….. 39

3-3- طرح آزمایشی و فاکتورهای مورد مطالعه …………………………………………………….. 40

3-4-1- مواد گیاهی ……………………………………………………………………………………………………… 40

3-4-2- استخراج DNA ژنومی گیاه ……………………………………………………………………… 41

3-4-2-1- استخراج DNA ژنومی به روش CTAB ……………………………………….. 41

3-4-2-2- نحوه تهیه ژل الکتروفورز ………………………………………………………………………… 42

3-5- انجام واکنش PCR …………………………………………………………………………………………… 43

3-6- مواد لازم جهت انجام PCR ……………………………………………………………………………. 43

3-6-1- آغازگر ……………………………………………………………………………………………………………….. 43

3-6-2- آنزیم Taq DNA Polymerase …………………………………………………………. 44

3-7- تنظیم شرایط برای PCR ………………………………………………………………………………… 44

3-8- الکتروفورز و رنگ آمیزی محصول PCR …………………………………………………….. 46

3-9- تجزیه و تحلیل داده ها ……………………………………………………………………………………… 46

فصل چهارم: نتایج و بحث

4-1- جوانه زنی و سبز شدن گیاهان ……………………………………………………………………….. 4٧

4-2- کمیت و کیفیت DNA استخراجی ………………………………………………………………. 4٨

4-4- روابط فیلوژنتیک بین ژنوتیپ ها ……………………………………………………………………… ٤٩

فصل پنجم: نتیجه گیری

5-١- نتیجه گیری …………………………………………………………………………………………………………. 5٢

5-٢- بحث ………………………………………………………………………………………………………………………. 5٣

5-٣- پیشنهادات ……………………………………………………………………………………………………………. 5٤

منابع فارسی …………………………………………………………………………………………………………………….. 5٥

منابع انگلیسی ………………………………………………………………………………………………………………….. 6٣

چکیده انگلیسی 6٧

چکیده

حبوبات دانه­های خوراکی هستند که به خانواده بقولات تعلق دارند. حبوبات بعد از غلات مهمترین منبع غذایی بشر به حساب می­آیند. عدس زراعی گیاهی از جنس Lens، گونه culinaris متعلق به تیره لگومینوزه، زیر­خانواده پروانه­آسا، از قبیله Vicieae می­باشد. عملیات اصلاحی در عدس در مقایسه با سایر محصولات مهم زراعی از قدمت کمتری برخوردار است و فعالیت نسبتا جدیدی است. با توجه به این موضوع لزوم تعیین تنوع ژنتیكی در این گیاه از اهمیت ویژه ای برخوردار است و استفاده از روش های جدید ارزیابی تنوع ژنتیكی به منظور انتخاب والدین دو رگ و تعیین میزان قرابت ارقام ضروری می باشد. دراین ارتباط بهترین روش استفاده از نشانگرهای مولكولی می باشد، زیرا تعیین تنوع به وسیله نشانگرهای مورفولوژیكی با توجه به اثرات متقابل محیط و ژنوتیپ و فنوتیپ گیاهان، كارایی شاخص های مورفولوژیكی را كم می نماید. در این مطالعه به منظور بررسی تنوع ژنتیكی 18 توده عدس خراسان شمالی از نشانگر مولكولی ISSR كه مبتنی بر PCR است، استفاده شد. برای استخراج DNA از روش CTAB استفاده شد و تكثیر ژنوم نمونه ها با استفاده از 10 پرایمر اختصاصی ISSR انجام پذیرفت. سپس با الكتروفورز ژل آگارز و رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید، قطعات تكثیر شده مورد ارزیابی قرار گرفتند که از مجموع 125 باند تولید شده 32 باند منومورف و 93 باند از آنها چند شکل بودند. درصد چند شکلی برای هر آغازگر از 5/28 درصد برای آغازگر E55تا 3/92 درصد برای آغازگر B22متغییر بود. در این بررسی توزیع مقادیر PIC بین 28/0 تا 49/0 با میانگین 45/0 متغییر بود. شاخص نشانگر در آغازگر های مورد مطالعه بین 9/7 تا 2/45 قرار داشت. بیشترین مقدار شاخص نشانگر متعلق به آغازگر B22 بود که نشان دهنده قدرت تفکیک بالاتر این آغازگر در مقایسه با سایر آغازگرها است. که با توجه به میزان محتوای اطلاعات چند شکلی آغازگرها وشاخص نشانگر، آغازگر­های B22 و RA3 و RR1 در بررسی تنوع ژنتیکی مناسب می­باشند. میزان فاصله ژنتیکی ژنوتیپ­ها با استفاده از روش UPGMA و در نرم­افزار NTSYS محاسبه و ارتباط ژنوتیپ­ها با استفاده از دندروگرام نشان داده شد. دندروگرام حاصل از تجزیه و تحلیل مجموع الگوهای باندی حاصل از پرایمرهای مورد استفاده، توده­ها را در سطح 5/61 درصد به 4 گروه تقسیم نمود. با توجه به اهداف این تحقیق می­توان به این نتایج رسید که بررسی تنوع ژنتیکی توده­های عدس با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR امکان پذیر بوده و با استفاده از این نشانگر می­توان توده­های مورد بررسی را به گروه­های مختلف تقسیم­بندی کرد. همچنین به وسیله فاصله ژنتیکی به دست آمده بین توده­ها، با توجه به درصد تشابه آنها می­توان توده­ها با فاصله ژنتیکی بیشتر را جهت استفاده در مراکز تحقیقاتی جهت تولید بذور هیبرید با هتروزیس مطلوب استفاده نمود.

کلمات کلیدی: تنوع ژنتیکی، چند­شکلی، عدس، نشانگر، ISSR

فصل اول:مقدمه

١-١-اهمیت و ضرورت انجام تحقیق

بقولات از متنوع­ترین تیره­های گیاهی جدا گلبرگ بوده که بعد از تیره کاسنی و ثعلب در رده نهاندانگان قرار دارند. این تیره مشتمل بر حدود ٧٥٠ جنس و ٢٠٠٠ گونه می­باشد (هیکی و کینگ، ١٩٩٧). از ویژگی­های مشترک تیره بقولات می­توان به وجود تخمدان یک برچه و آزاد، که پس از رسیدن تشکیل میوه­ای بنام لگوم یا غلاف (نیام) را می­دهد، اشاره کرد (مجنون حسینی، ١٣٨٧).

حبوبات دانه­های خوراکی هستند که به خانواده بقولات تعلق دارند (اسدی­چالش­تری و همکاران، ١٣٨٥). حبوبات بعد از غلات مهمترین منبع غذایی بشر به حساب می­آید. پروتئین حبوبات در جوامع بشری به خصوصاقشار کم درآمدنقش مهمی در تغذیه ایفا می­کند تا به آن حد که به گوشت فقرا معروف شده است (کوچکی و بنایان، ١٣٧٥). گیاهان خانواده لگومینوزه، در دوران کرتاسه پیدا شده­اند و به شرایط مرطوب آن زمان، که مشابه شرایط گرم و مرطوب امروزی است، سازگار شدند. بطور کلی اکثر گیاهان خانواده لگومینوزه به مناطق گرم سازگار شده­اند. ولی یکی از زیرخانواده­های آن، یعنی پروانه­آساها، دارای انعطاف زیادی بوده و به مناطق معتدل و سرد معتدله سازگار شده­اند (کوچکی، ١٣٨٨). این گیاهان منبع مهم ویتامین­هایی مانند ریبوفلاوین، ویتامین ب و کاروتن می­باشند و از لحاظ اسیدهای آمینه ضروری مخصوصا لیزین که کمبود آن در غلات وجود دارد غنی هستند (سینگ و همکاران، ١٩٨٢). طبق مطالعات انجام شده ترکیب مناسبی از پروتئین حبوبات با غلات می­تواند سوء تغذیه و کمبود اسیدهای آمینه را برطرف کند. در کشورهای در حال توسعه تقریبا یک چهارم نیاز پروتئینی توسط حبوبات تامین می­شود و عدس با دارا بودن حدود ٢٨ درصد نقش مهمی را در تغذیه مردم ایفا می­کند (پارسا و همکاران، ١٣٨٤). در میان گیاهان مناطق خشک و نیمه خشک، عدس از جمله گیاهانی است که غالبا در اراضی حاشیه­ای و در خاک­های نه چندان حاصلخیز کشت می­شود. این گیاه همچنین قادر است که از طریق تثبیت نیتروژن موجب بهبود حاصلخیزی خاک شود (استاویر و همکاران، ٢٠٠٣). مهمترین قاره تولید کننده عدس آسیاست که ٦٨ درصد کل تولید جهان را در اختیار دارد (توکلی، ١٣٨٢). معمولا گونه­های عدس را به دو گروه اصلی تقسیم می­کنند (کوچکی و بنایان، ١٣٧٥) :

١-میکرواسپرما : با بذرهای ریز گرد به قطر ٢ تا ٦ میلیمتر که رنگ پوسته بذر آن از زرد کمرنگ تا سیاه متغیر است.

٢-ماکرواسپرما : در این گروه بذرهای بزرگ­تر و پهن­تر هستند و رنگ پوسته بذر سبز کمرنگ است. این گروه از گیاهان دارای غلاف­ها و برگچه­های بزرگ­تری نسبت به گروه قبلی هستند. بطور کلی گیاهان میکرواسپرما قدیمی­تر بوده و گیاهان ماکرواسپرما از میان آنها انتخاب شده­اند.

عدس نسبت به سایر حبوبات دارای مدت پخت کوتاه­تری است و راحت­تر هضم می­گردد (وب و هوتین، ١٣٧٦). عدس در رفع یبوست و اختلالات روده­ای مفید است، همچنین در جلوگیری از سکته نیزموثر می­باشد. مرهم خمیر عدس جهت التیام زخم­های باقی مانده از آبله در طب سنتی توصیه شده است (مجنون ­حسینی، ١٣٨٧). مقدار پروتئین عدس با باقلا برابر و از نخود بیشتر است. عدس سرشار از آهن است و همچون باقلا و نخود منبع خوبی برای تیامین و نیاسین بوده، اما از نظر ویتامین B و کاروتن نسبتا فقیر است (نامدار و همکاران، ١٣٧٤). اگرچه عدس اساسا در تغذیه انسان استفاده می­شود ولی از آن در تغذیه حیوانات به ویژه ماکیان نیز استفاده می­گردد. کاه و دیواره­های غلاف و بقایای ناشی از کوبیدن آن از ارزش تغذیه­ای زیادی برای دام برخوردارند (وب و هوتین، ١٣٧٦).

عدس یکی از قدیمی­ترین گیاهان زراعی است که منشاء آن خاک­های حاصلخیز خاور نزدیک می­باشد. قدمت این گیاه به شروع کشاورزی باز می­گردد. در مقبره فراعنه مصر آثار خمیری محتوی عدس پخته بدست آمده است. نویسندگان یونانی در آثار خود به نام عدس اشاره داشته­اند و به نظر می­رسد که این گیاه به عنوان هدیه­ای برای خدایان مورد استفاده قرار می­گرفته است. رومیان نیز ارزش زیادی برای عدس قائل بوده­اند به­طوری که آن را از مصر وارد می­کرده­اند (کوچکی و بنایان، ١٣٧٥). نام عدس در کتاب­های مقدس دینی نظیر انجیل و قرآن ذکر شده است. در قرآن (سوره بقره) عدس یکی از محصولات زمینی بوده

که یهودیان از موسی(ع) خواستند که از خداوند برایشان درخواست نماید (وب و هوتین، ١٣٧٦). یکی از قدیمی­ترین آثار گیاهان خوراکی بقایای عدس است که مربوط به ٧٥٠٠ تا ٨٥٠٠ سال قبل از میلاد مسیح می­باشد (پارسا و باقری، ١٣٨٧).

به نظر می­رسد که عدس در منطقه­ای بین جنوب­غربی ترکیه و ترکمنستان از نژادهای وحشی خود اهلی شده است و به سمت نیل، یونان، اروپای مرکزی و متعاقب آن به سمت دانوب گسترش یافته باشد. بر اساس نظریه­های موجود عدس به دلیل نیازهای متفاوت اکولوژیکی موجود در گونه­های وحشی، پراکنش متفاوتی داشته و به مناطقی با شرایط مدیترانه­ای و همچنین در نواحی کوهپایه­ای جنوب­غربی آسیا سازگار شده است (کوچکی و بنایان، ١٣٧٥).

اصلاح کنندگان نباتات که در جهت دست­یابی به تنوع ژنتیکی موجود در کلکسیون ژرم­پلاسم فعالیت می­کنند، نیاز به داشتن اطلاعاتی در مورد میزان تنوع دارند. عملیات اصلاحی در عدس در مقایسه با سایر محصولات مهم زراعی از قدمت کمتری برخوردار است و فعالیت نسبتا جدیدی است. بهبود در عدس عمدتا بر اساس معرفی مواد انتخاب شده برای سازگاری به نواحی خاصی بوده است. در نتیجه بیشتر ارقام مورد استفاده امروزی بر اثر انتخاب در جمعیت­های نامتجانس بدست آمده و از عملیات هیبریداسیون استفاده نشده است. پیشرفت با استفاده از این روش محدود به تنوع موجود در این توده­ها و پیشرفت­های اصلاحی بعدی بستگی به هیبریداسیون و انتخاب خواهد داشت. کلکسیون­هایی برای حفاظت از ژرم­پلاسم عدس در آمریکا، هندوستان و سوریه ایجاد شده و از این نظر که تنوع ژنتیکی مورد نیاز برنامه­های اصلاحی هیبریداسیون را فراهم می­کند ارزشمند است.

با استفاده از روش­های انتخاب توده­ای والدین خالص در داخل ژرم­پلاسم یا نژادهای بومی می­توان به سهولت و سرعت به پیشرفت­های قابل توجهی دست یافت. این رو­ش­ها می­توانند در کوتاه مدت نیاز به واریته­های اصلاح شده و همچنین مواد ژنتیکی یکنواخت مورد نیاز در برنامه­های هیبریداسیون را فراهم کنند.

انتخاب توده­ای دو نوع گزینش را دربر می­گیرد :

١-حذف تیپ­های نامطلوب از یک مخلوط یا جمعیت­های متنوع و برداشت گیاهان باقی­مانده به صورت مخلوط.

٢-شناسایی تیپ­های برتر در جمعیت از طریق علامت­گذاری و یا هر روش دیگر و برداشت آنها به صورت مخلوط، نتیجه نهایی این دو روش کاهش فراوانی ژنوتیپ­های نامطلوب و افزایش فراوانی ژنوتیپ­های مطلوب خواهد بود.

انتخاب توده­ای ممکن است در هر نوع از منبع ژنتیکی (مثل نژادهای بومی، جمعیت­های هیبرید) که دارای تغییرات ژنتیکی کافی باشد و موفقیت را تضمین کند انجام شود (وب و هوتین، ١٣٧٦).

از آنجا که تنوع، اساس هر برنامه اصلاحی است، به طوری که موفقیت یک برنامه اصلاحی به طبیعت و یا حجم و تنوع موجود در مواد ژنتیکی بستگی دارد. وجود حداکثر تنوع، بزرگترین شانس برای نائل شدن به موفقیت در گزینش محسوب می­شود (میشرا و همکاران، ٢٠٠٧). با توجه به این که ایران یکی از مراکز تنوع عدس در جهان بوده و حتی پراکندگی دو گونه وحشی آن (Lens cyanea و Lens orientalis) نیز گزارش شده است (آقایی و همکاران، ١٣٨٣)، انتظار می­رود تنوع زیادی در میان توده­های بومی این محصول یافت شود. تنوع ژنتیکی بین و داخل جمعیت­های گونه­های گیاهی، یکی از موارد اصلی مورد مطالعه به­نژادگران و متخصصان ژنتیک می­باشد (هایوارد و بریز، ١٩٩٣). مور و کولینز دریافتند که توجه به ژرم­پلاسم گیاهان در طول نگهداری آنها، جهت پیش­بینی پتانسیل ژنتیکی و استفاده از آن در برنامه­های اصلاحی ضرووری است (مور و کولینز، ١٩٩٣). در استان خراسان شمالی عدس با سطح کشت ٢١٣١٢ هکتار که ٢٠٩٠٠ هکتار آن دیم می­باشد و با مقدار تولید ٨٣٦٣ تن بیشترین تولید و سطح کشت در بین سایر حبوبات را به خود اختصاص داده است که این مطلب خود بیان کننده جایگاه ویژه این محصول در استان می­باشد. با توجه به اهمیت گیاه عدس، انجام اقدامات اصلاحی در آن امری بسیار مهم می­باشد.