3

1-1-1 اهمیت موضوع…………………………………………………………………………………………………….

4

1-1-2 فرضیات………………………………………………………………………………………………………………

4

1-1-3 اهداف پژوهش…………………………………………………………………………………………………….

5

1-2 کلیات……………………………………………………………………………………………………………………..

5

1-2-1 گیاه شناسی………………………………………………………………………………………………………….

6

1-2-2 نیازهای اکولوژی………………………………………………………………………………………………….

6

1-2-3 خواستگاه و دامنه انتشار………………………………………………………………………………………..

7

1-2-4 خواص دارویی…………………………………………………………………………………………………….

7

1-2-5 موارد استفاده……………………………………………………………………………………………………….

8

1-2-6 مواد موثره و اجزاء اسانس……………………………………………………………………………………..

8

1-2-7 کشت بافت………………………………………………………………………………………………………….

9

1-2-7-1 انواع کشت بافت گیاهی……………………………………………………………………………………

10

1-2-7-2 بررسی اثرات فاکتورهای مختلف در محیط کشت…………………………………………………

10

1-2-7-3 نمک های غیرآلی………………………………………………………………………………………………

11

1-2-7-4 ویتامین ها………………………………………………………………………………………………………..

11

1-2-7-5 منبع انرژی………………………………………………………………………………………………………

11

1-2-7-6 میواینوسیتول……………………………………………………………………………………………………

12

1-2-7-7 عوامل فیزیکی………………………………………………………………………………………………….

12

1-2-7-8 ریزنمونه………………………………………………………………………………………………………….

12

1-2-7-9 چگونگی انتخاب محیط کشت…………………………………………………………………………..

13

1-2-7-10 ریزازدیادی گیاهان از طریق کشت بافت……………………………………………………………

13

1-2-7-11ریشه زائی……………………………………………………………………………………………………….

14

1-2-8 تعریف موتاسیون (جهش) ……………………………………………………………………………………

صفحه

عنوان

14

1-2-8-1 تاریخچه استفاده از موتاسیون…………………………………………………………………………….

15

1-2-8-2 سطوح ایجاد موتاسیون……………………………………………………………………………………..

15

1-2-8-3 انواع موتاسیون…………………………………………………………………………………………………

16

1-2-8-4 موتاژن (عامل جهش زا) ……………………………………………………………………………………

16

1-2-8-4-1 انواع موتاژن………………………………………………………………………………………………..

16

1-2-8-4-2 عوامل شیمیایی جهش زا………………………………………………………………………………..

18

1-2-8-4-3 مواد گیاهی مورد تیمار………………………………………………………………………………….

18

1-2-8-4-4 اصلاح به روش موتاسیون……………………………………………………………………………..

19

1-2-8-4-5 اهمیت موتاسیون در اصلاح نباتات. ……………………………………………………………….

19

1-2-8-4-6 موفقیت موتاسیون………………………………………………………………………………………..

19

1-2-8-4-7 روش های جدید استفاده از موتاسیون……………………………………………………………..

20

1-2-8-4-8 هدف موتاسیون مصنوعی………………………………………………………………………………

21

1-2-9 روغن های اسانس…………………………………………………………………………………………………

22

1-2-9-1 جداسازی و شناسایی مواد تشکیل دهنده روغن اسانسی گیاه…………………………………

فصل دوم:ی بر تحقیقات انجام شده

23

2-1 کشت بافت……………………………………………………………………………………………………………..

24

2-2 اثر موتاژن ها در ایجاد تنوع در صفات مختلف………………………………………………………………

26

2-3 اثر موتاسیون اتیل متیل سولفانات در ایجاد تنوع در سطوح مختلف…………………………………

فصل سوم: مواد و روش ها

32

3-1 مواد گیاهی………………………………………………………………………………………………………………

32

3-2 کشت بافت……………………………………………………………………………………………………………..

32

3-2-1 تهیه محلول ذخیره محیط های کشت……………………………………………………………………….

33

3-2-1-1 تهیه محلول ذخیره ماکرو…………………………………………………………………………………..

34

3-2-1-2 تهیه محلول ذخیره عناصر میکرو………………………………………………………………………..

34

3-2-1-3 تهیه محلول ذخیره آهن-سدیم…………………………………………………………………………..

35

3-2-1-4 تهیه محلول ذخیره ویتامین………………………………………………………………………………..

35

3-2-2 تهیه محیط کشت………………………………………………………………………………………………….

صفحه

عنوان

36

3-2-3 ضدعفونی نمونه های گیاهی…………………………………………………………………………………..

36

3-2-3-1 ضدعفونی اندام گیاه………………………………………………………………………………………….

37

3-2-4 تهیه ریزنمونه……………………………………………………………………………………………………….

37

3-2-5 بهینه سازی محیط کشت……………………………………………………………………………………….

37

3-2-6 بررسی نمونه های کشت شده…………………………………………………………………………………

38

3-2-7 تیمارهای مورد استفاده………………………………………………………………………………………….

38

3-2-7-1 روش تهیه استوک EMS …………………………………………………………………………………

39

3-2-7-2 روش اعمال تیمارهای EMS در گیاه کشت بافتی……………………………………………….

39

3-2-7-3 روش اعمال تیمارهای EMS در مزرعه……………………………………………………………..

39

3-2-7-4 روش شستشوی تیمارها……………………………………………………………………………………

40

3-3 استخراج مواد موثره گیاهی………………………………………………………………………………………..

40

3-3-1 روش های استخراج اسانس…………………………………………………………………………………….

40

3-4 آنالیز اجزاء اسانس……………………………………………………………………………………………………

41

3-5 آنالیزهای آماری……………………………………………………………………………………………………….

فصل چهارم: نتایج و بحث

42

4-1 بررسی نمونه های کشت بافتی…………………………………………………………………………………….

45

4-2 تاثیر EMS برروی خصوصیات مرفولوژیکی گیاه………………………………………………………..

46

4-2-1 اثر دوز EMS و زمان برروی طول ساقه…………………………………………………………………

47

4-2-2 اثر دوز EMS و زمان برروی طول ریشه………………………………………………………………..

47

4-2-3 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد برگ………………………………………………………………..

48

4-2-4 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه جانبی……………………………………………………..

49

4-2-5 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد جوانه………………………………………………………………

50

4-2-6 اثر دوز EMS و زمان برروی متوسط طول برگ………………………………………………………

51

4-2-7 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه……………………………………………………………….

51

4-3 ضریب همبستگی بین صفات و خصوصیات مورد بررسی……………………………………………..

52

4-4 استخراج اسانس……………………………………………………………………………………………………….

52

4-4-1 آنالیز و شناسایی کمی و کیفی اجزای موجود در اسانس…………………………………………….

صفحه

عنوان

53

4-4-2 نتایج آزمایشگاهی…………………………………………………………………………………………………

53

4-4-3 نتایج مربوط به طیف کروماتوگرام گازی گیاه…………………………………………………………..

54

4-4-4 ترکیبات تشکیل دهنده اسانس………………………………………………………………………………..

فصل پنجم: نتیجه گیری

55

5-1 بحث………………………………………………………………………………………………………………………

55

5-1-1 کشت بافت گیاهی………………………………………………………………………………………………..

56

5-1-2 اثرات موتاژن EMS ……………………………………………………………………………………………

60

5-2 نتیجه گیری………………………………………………………………………………………………………………

61

5-3 پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………….

62

فهرست منابع فارسی………………………………………………………………………………………………………..

64

فهرست منابع انگلیسی……………………………………………………………………………………………………..

71

پیوست ها………………………………………………………………………………………………………………………..

75

چکیده انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………….

چکیده

نعناع فلفلیبا نام علمیMentha piperitaیکی از انواع گیاهان دارویی می باشد که به دلیل تولید اسانس های با ارزش در صنایع داروسازی و بهداشتی استفاده های فراوانی دارد. استفاده از مواد موتاسیون زا از قبیل EMS می تواند تغییرات جهش زای نقطه ای در گیاه ایجاد کند که در نهایت منجر به ظهور فنوتیپ جدید در این گیاه با ارزش شوید. لذا این پژوهش با انجام تیمارهای متعدد از غلظت های مختلف EMS روی سرشاخه های رشد یافته در محیط کشت MS بدون هورمون و با غلظت های 0/0% (به عنوان شاهد)، 05/0% و 01/0% و 005/0% از EMS و مدت زمان های مختلف (24 و48 ساعت) و همچنین در قسمت مزرعه ای نیز از همین غلظت ها و زمان ها استفاده شد. ارزیابی در داخل لوله آزمایش و مزرعه بطور همزمان انجام گرفت. پس از انتفال و رشد و نمو نمونه ها در شرایطinvitro، تیمارها با ماده جهش زا اتیل متان سولفانات مورد بررسی قرار گرفتند. فاکتورهای مختلف مورفولوژیکی از قبیل طول ساقه و تعداد ریشه رونده جانبی در سطح 1% و تعداد برگ و تعداد جوانه در ساقه در سطح 5% پاسخ معنی داری را نشان دادند. نتایج این پژوهش نشان داد كه استفاده از مواد جهش زا در محیط کشت MS نقش بسزایی در تغییر فنوتیپی این گیاه دارویی دارد. غلظت 01/0% EMS بهترین نتیجه معنی دار را در سطح 1% و از کشت ریزنمونه های که شامل جوانه های جانبی و انتهایی بوده اند به دست آورده که برروی خصوصیاتی همچون طول ساقه، تعداد برگ و تعداد جوانه جانبی اثر داشت. آنالیز اسانس تیمارها نیز انجام شد که نتیجه آن بی اثر بودن این ماده اتیل متان سولفانات روی مواد اجراء اسانس این گیاه بوده است.

کلمات کلیدی: اتیل متیل سولفانات (EMS)، اجزاء اسانس، کشت درون شیشه ای، محیط کشت MS، نعناع فلفلی (Mentha piperita).

1-1 مقدمه:

گیاهان به عنوان یکی از اجزاء طبیعت، از دیرگاه پشتوانه غنی نیازهای بشری بوده اند و می توان با اطمینان گفت تا زمانی که انسان در این کره خاکی به سر می برد، به گیاهان نیاز دارد (سلیمان زاده، 1377).

در بحث گیاهان دارویی، محدودیت های کاشت و نگهداری آن ها متعدد می باشد که از آن جمله می توان به کوتاه بودن فصل کاشت و یا برداشت بعضی از گونه های گیاهی، کمبود زمین های مناسب جهت داشت، ناچیز بودن مواد موثره حاصل از گیاه و غیره اشاره کرد (ثقه الاسلام و موسوی، 1385).

یکی از راه های رفع این محدودیت ها کشت بافت گیاهی[1] است. تکنیک های کشت بافت گیاهی درحال حاضر به عنوان یک ابزار قوی جهت رفع مشکلات اساسی و کاربردی بیولوژی گیاهی درآمده است.

استفاده از گیاهان به عنوان دارو از زمان های خیلی دور در معالجه انسان و دام مرسوم بوده است. در حال حاضر حدود یک سوم داروهای مورد استفاده دارای منشاء گیاهی می باشند. کشورهای آسیایی بخصوص هند، چین و ایران سابقه بسیار طولانی در این زمینه دارند. این گیاهان مواد زیستی بخصوص و فعال با مقادیر بسیار کم تولید می کنند که تحت عنوان متابولیت های ثانویه نام گذاری می شوند. در عصر جدید، دانشمندان علوم گیاهی با استفاده از آخرین تکنیک های عملی کشت بافت گیاهی، توانسته اند از انواع گیاهان ترکیب های بسیار مفیدی را جهت مداوای بیماری های سخت و غیر قابل مداوا و موارد استفاده دیگر، بدست آورند. در طی چند دهه اخیر روش‎های متفاوتی با استفاده از بیوتکنولوژی[2] درزمینه پرورش محصولات گیاهی برتر ابداع شده است که از جمله آن ها می توان روش های ایجاد گونه های جهش یافته[3] و پلی پلوئید[4] را نام برد.