3-1- تهیه مواد گیاهی.. 32

3-2- ریزازدیادی.. 32

3-2-1- گند زدایی ریزوم ها 32

3-2-2- محیط کشت تکثیر. 33

3-2-3- تهیه و کشت ریزنمونه. 34

3-2-4- طرح آزمایشی و تجزیه و تحلیل آماری.. 34

3-3- جنین زایی سوماتیک… 36

3-3-1- تهیه محیط القاء کالوس… 36

3-3-2- ضدعفونی نمونه ها 36

3-3-3- تهیه و کشت ریزنمونه گره و میانگره 37

3-3-4- محیط پرآوری کالوس… 37

3-3-5- محیط کشت باززایی.. 38

3-3-6- طرح آزمایش و تجزیه و تحلیل آماری.. 38

فصل چهارم :نتایج و بحث

4-1- نتایج حاصل از آزمایشات صورت گرفته بر روی ریزازدیادی آلسترومریا رقم Fuego. 40

4-1-1- نتایج حاصل از اثرات سطوح مختلف BAP و NAA بر روی تعداد جوانه. 45

4-1-2- نتایج حاصل از اثرات سطوح مختلف BAP و NAA بر روی تعداد شاخه. 47

4-1-3- نتایج حاصل از اثرات سطوح مختلف BAP و NAA بر روی طول شاخه. 49

4-1-4- نتایج حاصل از اثرات سطوح مختلف BAP و NAA بر روی تعداد ریشه. 51

4-1-5- نتایج حاصل از اثرات سطوح مختلف BAP و NAA بر روی طول ریشه. 54

4-1-6- نتایج حاصل از اثرات سطوح مختلف BAP و NAA بر روی تعداد ریزوم. 56

4-2- نتایج حاصل از آزمایشات جنین زایی سوماتیک صورت گرفته در محیط کشت MS. 59

4-2-1- مرحله القاء کالوس… 60

4-2-1-1- اثر نوع ریزنمونه بر کالوس زایی.. 61

4-2-1-2- اثر BAP بر کالوس زایی.. 62

3-2-1-3- اثر NAA بر کالوس زایی.. 63

4-2-1-4- اثر متقابل نوع ریزنمونه و نوع BAP بر کالوس زایی.. 64

4-2-1-5- اثر متقابل نوع ریزنمونه و نوع NAA بر کالوس زایی.. 64

4-2-1-6- اثر متقابل نوع BAP و نوع NAA بر کالوس زایی.. 65

4-2-1-7- مقایسه تیمارهای اعمال شده با تیمار شاهد. 66

4-2-2- پرآوری کالوس… 66

4-2-4- بحث و نتیجه گیری.. 67

منابع. 69

چکیده

گل آلسترومریا با نام علمی(Alstroemeria psittacina)از خانواده ((Alstroemeriaceaeیکی از مهم ترین گلهای شاخه بریده در دنیا بوده که اخیراً برای تولید گلهای گلدانی و باغچه ای نیز استفاده می شود. این تحقیق به منظور بررسی و معرفی محیطی مناسب جهت ریزازدیادی و تولید کالوس های جنینی و جنین زایی سوماتیکی آلسترومریا انجام شد.

در بخش ریزازدیادی، جوانه های جانبی و انتهایی ریزوم به طول mm 6-4 از رقم فیگو پس از گندزایی بر روی محیط کشت MS حاوی 30 گرم در لیتر ساکارز، 7 گرم در لیتر آگار و غلظت های مختلف BAP و NAA کشت شدند و به فواصل هر 3 هفته واکشت شدند. جوانه های کشت شده از هفته سوم شروع به رشد نمودند. بیشترین تعداد شاخساره از محیط کشت حاوی 1 میلی گرم در لیتر BAP و 2/0 میلی گرم در لیتر NAA حاصل شد. همچنین نتایج نشان داد که با افزایش غلظت BAP به دلیل کاهش اثر غالبیت انتهایی، طول شاخساره ها کاهش یافته است. همچنین مقدار کم NAA جهت رشد شاخساره و ریزوم های اولیه ضروری بوده است. از آنجایی که در تکثیر آلسترومریا، تعداد ریزوم تکثیر یافته از تعداد شاخساره مهم تر می باشد، درنتیجه محیط کشت حاوی صفر میلی گرم در لیتر BAP و 1 میلی گرم در لیتر NAA با میانگین تعداد 3 ریزوم و 5 ریشه در هر ریزنمونه بهترین تیمار برای ریزازدیادی آلسترومریا رقم فیگو بوده است.

آزمایشات جنین زایی سوماتیک نیز در محیط کشت MS انجام شد. در این محیط کشت به منظور به دست آوردن کالوس های جنین زا، ریزنمونه های رویشی (گره و میانگره) و هورمون اکسین NAA در دو سطح (غلظت 1 و 2 میلی گرم در لیتر) همراه با تنظیم کننده رشد سایتوکنین BAP در دو سطح (غلظت 0 و 5/0 میلی گرم در لیتر) مورد استفاده قرار گرفت. بهترین ریزنمونه جهت بدست آوردن کالوس های جنین زا، گره ها بودند. ریزنمونه های میانگره اگرچه مستعد تولید کالوس های جنینی بودند اما در مقایسه با گره ها دارای درصد کالوس زایی پائین تری بودند. بهترین تیمار هورمونی برای بدست آوردن کالوس های جنین زا، 2 میلی گرم در لیتر NAA بوده است. کالوس های به دست آمده، 3 ماه پس از کشت جهت پرآوری به محیط کشت MS تغییر داده شده حاوی 5 میلی گرم در لیتر پیکلرام منتقل شدند. جنین زایی سوماتیک و باززایی گیاه از این جنین ها، پس از انتقال کالوس های جنینی توده ای به محیط کشت باززایی حاوی غلظت های مختلف BAP صورت گرفت. بیشترین گیاهچه از محیط کشت MS حاوی 5/0 میلی گرم در لیتر BAP حاصل شد.

کلمات کلیدی:آلسترومریا، ریزازدیادی، جنین زایی سوماتیک، نفتالین استیک اسید، بنزیل آمینو پورین.

فصل اول

مقدمه و کلیات

1-1- مقدمه

فناوری کشت بافت و سلول در دومین انقلاب سبز، که بر اساس تغییر ژن و دستکاری ژنتیکی برای بهبود کیفیت و کمیت محصولات پایه گذاری شد، نقش کلیدی دارد. کشت بافت و سلول گیاهی به روشی گفته می شود که اجزای مختلف گیاه شامل سلول، پروتوپلاست، جنین، بافت، اندام و غیره در شرایط آزمایشگاهی و به طور کامل سترون روی یک محیط غذایی قرار می گیرند و در شرایط محیطی مناسب نگهداری می شوند. این روش در سطح کم وسعت در مقایسه با کشت های مزرعه ای و با استفاده از محیط غذایی مشخص و عاری از هر گونه آلودگی صورت می گیرد .

روش های اصلی برای ایجاد کالوس دهی و باززایی، شامل روش هایی است که هم کاربرد تجاری مستقیم دارند و به همان اندازه نیز امکان پژوهش های پایه های ژنتیکی و بیو شیمیایی در سلول را فراهم می آورند. این روش ها شامل انواع کشت بافت و سلول های گیاهی، مانند بساک، تخمک (تخمدان)، بذر، ساقه، برگ، کالوس، جداسازی پروتوپلاست و امتزاج آنها، انتخاب سلول، کشت مریستم و جوانه، و همچنین تغییر ژنتیکی سلول ها و گیاهان است (سید طباطبایی و امیدی، 1388).

امروزه از تکنیک های کشت بافت در سراسر جهان به منظور تولید بسیاری از گیاهان با اهداف گوناگون استفاده می شود. این تکنیک ها دامنه وسیعی از روش های مختلف را بسته به محیط های کشت مورد استفاده، ریزنمونه مورد نظر، چگونگی انتقال از فازهای مختلف فرآیند و … را در بر می گیرند.

یکی از مهم ترین روش های کشت بافت، ریزازدیادی است که به منظور تکثیر انبوه گیاهان در زمانی کوتاه به کار می رود. در این روش از قسمت های مختلف گیاه ریزنمونه تهیه شده و با استفاده از ترکیبات غذایی و هورمونی مناسب مستقیماً به فاز باززایی هدایت می شوند. در واقع این تکنیک می تواند جایگزینی برای روش های سنتی تکثیر غیر جنسی در بسیاری از گیاهان باشد.

یک روش بسیار پرکاربرد ریزازدیادی کشت مریستم و نوک ساقه است. مریستم شامل سلول های به سرعت در حال تقسیم است، از این رو از این تکنیک برای تولید تجاری گیاهان و همین طور تولید گیاهان عاری از ویروس به طور وسیعی استفاده می شود. گیاهان به دست آمده از این طریق، پایداری ژنتیکی زیادی نشان می دهند، از این رو برای انجام تحقیقات بیوتکنولوژیکی بسیار مناسب هستند.

1-2- تاریخچه آلسترومریا

آلسترومریا (Alstromeria sp.)که در ایران با نام سوسن پرویی نیز خوانده می شود، گیاهی دگرگشن بوده که خاستگاه آن آمریکای جنوبی است. این جنس دارای گونه های فراوانی در خانواده آلسترومریاسه است که امروزه تعدادی از آنها به عنوان گیاهان زینتی برای تولید گل های شاخه بریده، گیاهان باغی، باغچه ای و یا گلدانی پرورش داده می شوند) باند و الدرسون، 1993).

درحال حاضر آلسترومریا به علت داشتن گل های زیبا و بادوام در بازارهای جهانی گل و گیاه به عنوان یکی از مهم ترین و پرطرفدارترین گل های زینتی شاخه بریده به شمار می رود (خالقی و همکاران، 2008).

آلسترومریا به طور معمول با استفاده از ریزوم تکثیر می شود، اما آلودگی های ویروسی، سرعت کم تکثیر و محدودیت های فصلی، سبب محدود شدن استفاده از این روش شده است (وان و همکاران، 1996).

شکل 1-1- نمونه هایی از گل آلسترومریا

شکل 1-2- گل آلسترومریا رقم Fuego

درحال حاضر برای فایق آمدن بر مشکلات روش های معمول تکثیر این گیاه زینتی و تولید گیاهان عاری از ویروس، استفاده از روش های کشت درون شیشه ای در این گیاه اهمیت زیادی پیدا کرده است. برای تکثیر این ویتروی آلسترومریا معمولاً از ریزنمونه های جوانه انتهایی شاخه (پدراز سانتوز و همکاران،2005)، جوانه جانبی (لین و همکاران، 1997) و ریزوم (لین و همکاران، 1987) استفاده می گردد. با این وجود سرعت باززایی جوانه انتهایی ریزوم (نوک ریزوم) از سایر ریزنمونه ها بیشتر گزارش شده است (لین و همکاران، 1987).

1-3- مشخصات گیاه شناسی آلسترومریا

آلسترمریا (Alstromeria) از گیاهان زیر رده تک لپه ایها متعلق به خانواده آلسترومریاسه می باشد. آلسترومریا گیاهی است علفی، چند ساله، ریزوم دار با گلهایی به رنگ های مختلف که حدود 60 گونه دارد که منشا همگی از جنوب آمریکا می باشد (بیکر، 1888؛ آفوت، 1952؛ رابینسون، 1963). آلسترومریا دارای انواع مختلفی می باشند که می توانند در شرایط گوناگونی همچون سواحل شنی (A.peregrina L.)، بیابانها (A.Violacea phil)، جلگه های آبرفتی (A.heamantha Ruiz)، دشتهای نیمه جنگلی (A.aurantiaca D.Don) و مناطق سرد کوهستانی (A. Nivalis phil. In Lin) رشد و نمو کنند (هنس و ویلکینز، 1979 ). این گیاه دارای ریزوم های سفیدی می باشد که از آن شاخه های هوایی منشا می گیرند. شاخه ها بسته به دمای خاک، طول روز و شدت نور می توانند بصورت رویشی یا زایشی باشند (وانک نوردیروف، 1975؛ هیلی و همکاران، 1982).