2

1-1-2 تاریخچه گیاهان دارویی ………………………………………………….

3

1-2 به لیمو ……………………………………………………………………

5

1-2-1 تاریخچه و معرفی به­لیمو…………………………………………………..

5

1-2-2 به­لیمو (Lemon verbena) از نظر رده­بندی گیاهی ………………………………..

6

1-2-3 گیاه­شناسی به­لیمو ……………………………………………………….

6

1-2-4 نام­های دیگر به­لیمو ………………………………………………………

6

1-2-5 گونه های دیگر به لیمو …………………………………………………….

6

1-2-6 منشأ و پراکنش به­لیمو در ایران …………………………………………….

7

1-2-7 اهمیت اقتصادی به­لیمو ……………………………………………………

8

1-2-8 روش پرورش گیاه به­لیمو …………………………………………………

8

1-2-9 زمان جمع­آوری به­لیمو ……………………………………………………

9

1-2-10 خواص دارویی و كاربردهای به­لیمو ………………………………………..

10

1-2-11 مواد تشكیل­دهنده اسانس به­لیمو …………………………………………..

10

1-2-12 فرمول­های شیمیایی و شكل نمایی از برخی مواد تشكیل دهنده­ی اسانس به لیمو ……..

11

1-3 كشت بافت ………………………………………………………………

12

1-3-1 کشت کالوس …………………………………………………………..

14

1-3-2 تولید متابولیت­های ثانویه …………………………………………………

14

1-3-3 باززایی گیاه ……………………………………………………………

15

1-4 کشت بافت گیاهان دارویی …………………………………………………..

15

1-5 اهمیت تكثیر به­لیمو از طریق كشت­بافت ………………………………………..

17

1-6 اهداف تحقیق …………………………………………………………….

17

فصل دوم:ی بر تحقیقات انجام شده

2-1 گیاهان دارویی ……………………………………………………………

18

2-2 کشت بافت به­لیمو …………………………………………………………

20

2-3 کشت بافت در سایر گیاهان ………………………………………………….

21

2-4 میزان ماده موثره به­لیمو ………………………………………………………

22

2-5 خواص ضدمیکروبی به­لیمو ………………………..…………………………

23

2-6 تغذیه و کودهای زیستی …………………………………………………….

24

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1 زمان و مكان انجام آزمایش …………………………………………………..

30

3-2 مواد گیاهی ………………………………………………………………

30

3-3 عملیات كشت بافت ………………………………………………………..

30

3-3-1 ترکیبات هورمونی بکار رفته در محیط کشت­ ………………………………….

30

3-3-2 طرز تهیه محلول های ذخیره ای تركیبات محیط كشت ……………………………

31

3-3-3 آماده­سازی تنظیم کننده­های رشد گیاهی ………………………………………

32

3-3-3-1 تهیه محلول پایه BAP ………………………….………………………

32

3-3-3-2 تهیه محلول پایه كینتین …………………………….……………………

32

3-3-3-3 تهیه محلول پایه2,4-D …………………………….…………………..

32

3-3-3-4 تهیه محلول پایه NAA……………………………..……………………

32

3-3-4 آماده سازی محیط کشت های مختلف ………………….………………………

32

3-3-4-1 آماده سازی محیط کشت جامد ……………………………….……………

34

3-3-4-2 آماده سازی محیط کشت مایع …………………………….………………

34

3-3-5 تهیه و سترون سازی ریزنمونه­های به­لیمو …………………………………….

34

3-3-6 كشت ریزنمونه­های به­لیمو ………………………………………………..

35

3-3-7 روش یادداشت­برداری و صفات مورد مطالعه ………………………………….

35

3-3-8 تجزیه­ و تحلیل آماری ……………………………………………………

36

3-4 كشت آزمایش مزرعه ای به لیمو ……………………………………………….

36

3-4-1 آماده­سازی مزرعه ………………………………………………………..

36

3-4-2 آزمایش خاك ……………………………………………………………

37

3-4-3 تهیه و انتقاال نهال­های به­لیمو ………………………………………………

37

3-4-5 آبیاری مزرعه ……………………………………………………………

37

3-4-6 اعمال تیمارهای كودی …………………………………………………….

37

3-4-7 یادداشت­برداری صفات مورد مطالعه …………………………………………

38

3-4-8 روش برداشت و خشك­كردن به­لیمو …………………………..…………….

38

3-4-9 اسانس­گیری ……………………………………………………………

39

3-4-10 تجزیه و تحلیل آماری طرح مزرعه ………………………………………….

40

فصل چهارم: نتایج و بحث

4-1 نتایج حاصل از کشت ریزنمونه­های به لیمو برروی محیط کشت­های MS حاوی 4 نوع ترکیب هورمونی NAA و BAP …………………………………………..………………

41

4-2 نتایج حاصل از کشت ریزنمونه­های به لیمو برروی محیط کشت­های MS حاوی 6 نوع ترکیب هورمونی NAA و 2,4-D وBAP و كینتین ……………………………………………

45

4-3 نتایج حاصل از کشت ریزنمونه­های به لیمو برروی محیط­کشت­های MS حاوی 5 نوع ترکیب هورمونی NAA و BAP ………………………………………………..…………

48

4-4 نتایج بهترین حالت‎های کشت بافت برای گیاه به لیمو در شرایط آزمایشگاهی………………….

52

4-5 نتایج حاصل از بررسی تاثیر كودی بر عملكرد و خصوصیات مورفولوژیكی به­لیمو در شرایط مزرعه ……………………………………………………………………….

52

4-4-1 آزمون خاك ……………………………………………………………

52

فصل پنجم: نتیجه گیری

5-1 نتیجه گیری و جمع بندی ……………………………………………………..

55

5-2 نتایج آزمایش های درون شیشه ای ……………………………………………..

55

5-2-1 آزمایش اول ……………………………………………………………

55

5-2-2 آزمایش دوم ……………………………………………………………

58

5-2-3 آزمایش سوم ……………………………………………………………

60

5-3 آزمایش مزرعه ای ………………………………………………………….

61

5-4 پیشنهادات ………………………………………………………………..

63

فهرست منابع …………………………………………………………………

64

چکیده انگلیسی ……………………………………………………………….

69

چکیده

جنسLippiaدارای بیش از 200 گونه است كه در این بین گونهLippiacitriodoraL. دارای ارزش بالای دارویی می­باشد. این گیاه به دلیل اهمیت فراوان اقتصادی در صنایع غذایی، داروسازی و عطرسازی در قسمت های مختلفی از ایران كشت و كار می­شود و گونه­های بومی­ نیز از جنسLippiaدر مناطق گرمسیری و نیمه­گرمسیری كشور وجود دارد. بدین منظور دو آزمایش جداگانه در شرایط درون شیشه ای و مزرعه ای انجام شد. در شرایط آزمایشگاهی سه آزمایش جداگانه با استفاده از طرح کاملا تصادفی با 4 تکرار انجام شد و در آن اثر 13 تیمار مختلف هورمونی (BAP، NAA، 2,4-D و كینتین) و اثر زمان بر میزان كالوس زایی و باززایی ریزنمونه های به لیمو بررسی گردید. با توجه به نتایج تجزیه واریانس در آزمایش درون شیشه ای در غلظت‎های مختلف هورمونی، صفت‎های ریشه‎زایی، ساقه‎زایی، کالوس‎زایی، تغییررنگ، تغییرشکل در سطح یك درصد معنی دار شدند. در مقایسه ی میانگین بین تیمارهای مورد بررسی مشخص شد كه محیط کشت MS12 حاوی 3/0 میلی گرم بر لیتر اكسین NAA بدون سیتوكنین برای صفت های ریشه زایی، كالوس زایی، زنده مانی، تغییر رنگ و تغییرشكل به ترتیب با 8/63، 6/91، 100، 2/97 و 2/92 درصد بهترین تیمار هورمونی بود، ولی در مورد ساقه زایی، محیط كشت MS بدون هورمون با 3/68 درصد بیشترین تعداد نوساقه ها را ایجاد نمود. در آزمایش مزرعه ای نیز از بین چهار سطح كودی مختلف شامل صفر، 50 و 100 كیلوگرم در هكتار ازته و غلظت سه در هزار NPK بر روی صفات مورفولوژیكی و میزان عملكرد گیاه به­لیمو، تیمار 50 كیلوگرم در هكتار كود ازته بهترین نتایج را در بر داشت.

کلید واژه: به لیمو، كالوس زایی، ساقه زایی، ریشه زایی، ترکیبات هورمونی، کود ازته.

1-1 گیاهان دارویی

1-1-1 اهمیت كشت گیاهان دارویی

با ظهور داروهای شیمیایی و بیولوژیك، نقش و اهمیت گیاهان دارویی در تأمین سلامت بشر، در معرض فراموشی قرار گرفت. اما با گذشت زمان، استقبال از گیاهان دارویی با رشد قابل توجهی روبرو شده است. به­نظر می­رسد مردم جهان از یك سری نارسایی­های طب مدرن خسته شده­اند و به طور روز افزون به سمت داروهای گیاهی روی می­آورند. اصولاً زمانی كه قانون ابن­سینا را در غرب به آتش كشیدند و ادعا كردند شیمی، مولكول و فیزیولوژی را شناخته­اند، طب به انحراف كشیده شد. به­طوری كه هم­اكنون طب مدرن توانایی حل بسیاری از مشكلات بشر را ندارد و طی سال­های اخیر در كتب درسی به این موضوع اعتراف كرده­اند. به­همین دلیل، امروزه حدود 50 درصد داروهای تولید شده در جهان منشاء طبیعی دارند كه با تغییراتی به­عنوان دارو مورد استفاده قرار می­گیرند. كه نیمی از این مقدار از منابع معدنی، حیوانی و باكتریایی بدست می­آید و نیمی دیگر منشاء گیاهی دارد. برای مثال، تمام هورمون­های مصرفی گیاهی هستند و از گیاهان مختلفی نظیر سیب­زمینی مكزیكی، شنبلیله و غیره به­دست می­آیند. همچنین تركیباتی مثل وین­بلاستین و وین­كریستین كه از داروهای ضدسرطان هستند از گیاه بدست می­آیند و یا گلیكوزیدهای قلبی از جمله این گروه داروها محسوب می­شوند (قاسمی دهكردی و همكاران، 1380).

گیاهان دارویی یكی از مهم ترین منابع دارویی می­باشند كه از هزاران سال پیش كاربرد داشته­اند. سازمان بهداشت جهانی تخمین زده است كه بیش از 80 درصد از مردم به­صورت سنتی و یا مدرن از گیاهان دارویی استفاده می­كنند. بعلاوه برخی از داروهای شیمیایی نیز با الگوبرداری از مواد گیاهی ساخته شده­اند (تریپاتی[1] و تریپاتی، 2003).

در قرن اخیر دانشمندان به زیان­های ناشی از سموم شیمیایی، مواد افزودنی، اسانس و طعم­دهنده­های مصنوعی كاملاً پی­برده­اند و بروز انواع سرطان­ها و بیماری­های مختلف تأییدكننده این موضوع می­باشند. بر این اساس كشورهای پیشرفته كه دارای امكانات تحقیقاتی گسترده ای در مورد شناسایی این مواد مضر بوده اند، تصمیم گرفته­اند كه در چند سال اخیر كلیه­ی مواد مصرفی شیمیایی را از مواد غذایی، دارویی، آرایشی و بهداشتی بتدریج حذف نموده و بجای آن از منابع گیاهی استفاده كنند .كشور ما دارای غنی­ترین منابع گیاهی از نظر مقدار و تنوع در سطح جهان می­باشد .هم­اكنون كشورهای پیشرفته پی به ارزش گیاهان دارویی و صنعتی برده و درصدد كشت و پرورش آنها در سایر كشورهای فقیر شده­اند. شناسایی گیاهان اسانس­دار گامی مهم در جهت اهلی كردن و ترویج شیوه­های صحیح بهره­برداری و استفاده از این گیاهان می‎باشد. گیاهان دارویی اسانس­دار نقش مهمی در زندگی انسان دارند و در ایران از سابقه طولانی برخوردار می­باشند (موسویان و بصیری، 1378).

در گذشته گیاهان دارویی جمع­آوری شده از طبیعت برای رفع نیازهای بازار كافی بود، طی سالیان گذشته تعدادی از گونه­های پرمصرف در خطر انقراض قرار گرفته­اند، برای رفع نیازهای فزاینده به داروهای گیاهی، گیاهان بایستی كشت شوند، علاوه بر اطمینان از منابع كافی كشت گیاهان دارویی باعث تولید مواد خام دارویی با كیفیت یكنواخت و خصوصیات شناخته شده می­گردد. از سوی دیگر تامین مواد اولیه برای صنایع داروسازی نیاز به افزایش تولید محصول در واحد سطح دارد كه علمی­ترین و اقتصادی­ترین روش دستیابی به­این مهم افزایش كارایی نهاده­های مورد استفاده در زراعت گیاهان دارویی می­باشد (توماس[2]، 2000).

كشت یك گیاه دارویی از نظر اقتصادی وقتی مقرون به­صرفه است كه متابولیت­های ثانویه آن به­حد مطلوب رسیده باشد، با شناخت عوامل محیطی موثر در تولید و انتخاب ارقام گیاهی مناسب می­توان به­حد اكثر مقدار محصول دست یافت (امیدبیگی، 1386). در مناطقی مثل ایران وجود نور فراوان یكی از منابع مهم و بالقوه در تولید گیاهان دارویی است كه باید یا مناسب­ترین روش­ها از آن استفاده كرد (امیدبیگی، 1386). در شرایطی كه هیچ­گونه محدودیت عوامل محیطی وجود نداشته باشد، تولید ماده خشك گیاهی با مقدار نور جذب شده متناسب است (مونتیس[3]، 1994).

1-1-2 تاریخچه گیاهان دارویی

با نظری اجمالی به فرهنگ مصرف داروهای گیاهی در ایران می­توان متوجه میراث با ارزش این گیاهان در طب غنی سنتی ایران شد. از طرفی فلات وسیع ایران از اقلیم­ها و محیط­های گوناگون برخوردار است، به­همین دلیل بیش از 7500 گونه گیاهی مختص به ایران است. از این رو به­حق، فلور ایران یكی از منابع داروخیز جهان محسوب می­شود. از آنجایی كه گیاهان وحشی در محدوده­های جغرافیایی گسترده­ای یافت می­شود، جمع­آوری و دسترسی به آنها از نظر اقتصادی مقرون به­صرف نیست و استفاده از گیاهان وحشی جوابگوی صنایع داروسازی نخواهد بود و چنین استفاده­ی انبوه از گیاهان طبیعت مسلماً موجب نابودی آنها خواهد شد. از این رو نسبت به كشت این گیاهان در سطوح زراعی اقدامات مفیدی در سطح كشور انجام شده است. گزارش شده است كه انسان دیر و یا زود چاره­ای به­جز بازگشت به طبیعت خود نخواهد داشت. از این رو، در كشورهای توسعه یافته اقدامات وسیعی را در توسعه و پیشرفت كشت و استفاده از گیاهان دارویی انجام شده است. امید است در كشور ما با تربیت نیروی متخصص و فرهنگ­سازی استفاده از گیاهان دارویی، از این نعمت الهی بی­نصیب نمانیم (ابراهیم­پور و عیدی­زاده، 1388).

ابن­سینا، دانشمند و پزشك نامدار ایرانی در سال­های 428-370 هجری مطابق با 980-1037 میلادی كه در غرب او را به­نام آویسینیا می شناسد و پس از انقراض تمدن یونان او را بزرگ ترین دانشمند جهان و به اشتباه، عرب دانسته­اند (چون كتاب­های او به عربی نوشته شده است). در جلد دوم كتاب قانون فی­الطب بیش از 800 نمونه گیاه طبی و غذایی را نام می­برد كه از آن میان 541 گیاه و مشتقات آنها دارای توصیف كاربردی و صفات ریخت­شناختی هستند. او اختلاف شكل و صفات گیاهان مشابه یا نزدیك به هم را (برای اجتناب اشتباه آنها از یكدیگر) با توجه خاصی در كتاب “قانون” توضیح می­دهد و در مورد چگونگی استفاده از مشتقات گیاهان دارویی و كاربرد آنها، با ترتیبی خاص، معین و نظام یافته به شرح و تفصیل آنها می­پردازد (زارع­زاده، 1383).

آلبرت ماگنیوس[4] این كشیش كه در نوشته ها به آلبرت بوستادت بیشتر معروف است، در سال های 1193-1280، بعد از ابن­سینا و بیرونی در ایام و بحران فكری قرون وسطی اروپا، درباره طب و تاریخ طبیعی و همچنین گیاه­شناسی كتابی به نام رستنی­ها، دو وژتابلیس[5] را نوشت. محتویات و نحوه نگارش این كتاب، به خوبی نشان می­دهد كه آلبرت كبیر نیز تحت تأثیر شدید تئوفراست و دیگر دانشمندان و قدمای رم و یونان مورد قبول كلیسا قرار داشت و در عین حال، برخی مشاهدات خود را نیز در این كتاب آورده است (زارع­زاده، 1383).

ایرانیان از دیرباز و حتی پیش از دیگران در زمینه گیاهان دارویی و كاربرد درمانی آنها از دانش پیشرفته ای برخوردار بوده­اند. نمونه بارز آن كتاب باستانی اوستاست .در«وندیداد» یكی از پنج كتاب تشكیل­دهنده اوستا (كه در مجموع دست­كم 2500 سال پیشینه دارد)، بخش­های پرشماری به گیاه درمانی، معرفی گیاهان دارویی و كاربرد آنها اختصاص یافته است. اما متأسفانه در لشكركشی اسكندر مقدونی، كتابخانه مشهور اسكندریه در آتش­سوزی عمدتاً نابود شد و بیشتر منابع و آثار و كتاب­های جمع­آوری شده در آن سوخت و خاكستر شد. بدین ترتیب، سوابق گیاه­شناسی شرق كهن در دو تمدن ایران و مصر بر اثر این آتش­سوزی­ها، فاقد هر گونه مدرك دیرینه شناخت گیاهان دارویی و خواص آنها گردید. متأسفانه بعدها نیز بر اثر تخریب قلاع فرقه اسماعیلیه و آتش زدن كتابخانه­های آن بوسیله هلاكوخان مغول، بقیه آثار مكتوب گیاهان دارویی، كه توسط این فرقه جمع­آوری شده بود، از میان رفت، تا اینكه در قرن هشتم و نهم میلادی، اطباء ایرانی رونق خاصی به طبابت ایران و جهان بخشیدند. بطوریكه با پیدا شدن دانشمندان و نوابغی نظیر ابوعلی­سینا و محمد زكریای رازی با انشار كتاب­های معروف خود (قانون و الحاوی) پیشرفت­های زیادی نصیب ملت ایران و جهانیان گردید. این پیشرفت­ها همچنین در قرون بعد نیز ادامه یافت. در قرن 13 میلادی، ابن­بیطار، اختصاصات متجاوز از 14700 گیاه را كه خود شخصاً می­شناخت را در كتابش شرح داد (دوازده امامی، 1386؛ زارع­زاده، 1383).

1-2 به لیمو

1-2-1 تاریخچه و معرفی به­لیمو

گیاه به­لیمو (شکل 1-1) با نام علمیLippiacitriodoraاز خانواده شاه­­پسند (Verbenaceae) (مظفریان، 1389؛ زرگری، 1375)، این گیاه بومی آمریکای جنوبی است (زرگری، 1375) و به­نام پزشک گیاه­شناسی موسوم به Lippi که در سال­های 1678 تا 1704 میلادی می­زیسته و در حبشه به­قتل رسید، نامگذاری شده است (زرگری، 1375). در فرهنگ گیاه­درمانی ایران، برگ­های این گیاه به­صورت دم­کردنی به­منظور آرامبخش، ضدتشنج و برطرف­کننده تپش قلب و سرگیجه مصرف دارد (امین، 1388). تا 100 سال پیش فقط به­عنوان یك گونه زینتی شناخته می­شد، ولی امروزه به­دلیل اهمیت فراوان اقتصادی آن در صنایع غذایی و عطرسازی در اكثر كشورها از جمله در ایران و به ویژه در استان گلستان كشت شده و به خوبی پرورش می­یابد. امروزه این گیاه در شمال كشورمان كشت و كار می­شود و گونه­های بومی آن از جنسLippiaدر مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری كشورمان وجود دارد (امین، 1370).

1-2-2 به­لیمو (Lemonverbena) از نظر رده­بندی گیاهی

به لیمو از سلسله­ی Planta، شاخه­ی Magnoliophyta، رده­ی Magnoliopsida، راسته­ی Lamiales، خانواده Verbenaceae، جنس Aloysia، و گونه­یA.triphylla، است(آنونیموس[6]، 2007).

1-2-3 گیاه­شناسی به­لیمو

به­لیمو درختچه­ای کوچک به ارتفاع تا 90-100 سانتیمتر، با شاخه­های شیاردار و کم و بیش زبر برگ­ها در چرخه­های 3 یا 4 تایی، سرنیزه­ای، به­طول 5- 5/7 سانتیمتر، با دمبرگ کوتاه، کامل یا در میانه دندانه­دار، بدون کرک، در سطح تحتانی به­انبوهی پوشیده از کرک­های غده­دار (منقوط)، با بوی لیمو سنبله­ها چرخه­ای و محوری یا مجتمع شده در پانیکول­های انتهایی اغلب 3 تایی. گلها سفید، به طول 5/4- 5 میلیمتر، شکوفا و گل­دهنده در تابستان و پاییز. کاسه گل به انبوهی کرکدار. لوله جام گل بلندتر از کاسه (زرگری، 1375).

1-2-4 نام­های دیگر به­لیمو

برای به لیمو نام های دیگری نیز در منابع ذكر شده است كه به تعدادی از آن ها اشاره می شود.

Lippia citriodoraKunth (آزادبخت، 1378؛ زرگری، 1371؛ كریمی، 1381؛ یزدانی و همكاران، 1383)Lippia citriodoraH.B.U.K (راشدی، 1380؛ كریمی، 1381)

Lippia triphylla(راشدی، 1380؛ صمصام شریعت، 1374)

Verbena triphyllaL Herit (رضایی و همكاران، 1380؛ یزدانی و همكاران، 1383)

Aloysia citriodoraorteg (رضایی و همكاران، 1380؛ یزدانی و همكاران، 1383)