2-5-1- روش های کشت……………………………………………………………………………………………29

2-5-2- روش سرولوژیکی………………………………………………………………………………………….30

2-5-3- روش الایزا…………………………………………………………………………………………………. 30

2-5-4- روش آگلوتیناسیون به كمك لاتكس………………………………………………………………. 31

2-5-5-1-روشPCR……………………………………………………………………………………………….. 31

2-5-5-2- جستجو وآنالیز محصولاتPCR………………………………………………………………. 31

2-5-5-3- بهبود حساسیت و ویژگی تکثیرPCR………………………………………………………….33

2-5-5-4- اجزای PCR…………………………………………………………………………………………..33

2-5-5-5- سابقه PCR در شناسایی سالمونلا……………………………………………………………….34

فصل سوم:مواد و روش ها ………………………………………………………………………………………….44

3-1- وسایل مورد استفاده…………………………………………………………………………………………..45

3-2- مواد مورد استفاده………………………………………………………………………………………………46

3-3- گرد آوری نمونه های آزمایشی……………………………………………………………………………46

3-4-1- مواد و وسایل لازم برای تهیه محیط…………………………………………………………………46

3-4-2- مواد و وسایل لازم جهت کشت نمونه……………………………………………………………..46

3-4-3- کشت در محیط جامد انتخابی…………………………………………………………………………47

3-5- آزمون های بیوشیمیایی………………………………………………………………………………………47

3-5-1- کشت در محیط آهن دار سه قندی…………………………………………………………………..47

3-5-2- آزمون اوره آز……………………………………………………………………………………………… 48

3-5-3- آزمون وژس پروسکوئر………………………………………………………………………………….48

3-5-4- آزمون اندول…………………………………………………………………………………………………..49

3-5-5- آزمون سیترات………………………………………………………………………………………………49

3-5-6- آزمون حرکت………………………………………………………………………………………………..49

3-6- آزمون رنگ آمیزی گرم……………………………………………………………………………………..49

3-6-1- تهیه گسترش روی لام…………………………………………………………………………………..50

3-6-2- رنگ آمیزی با کریستال ویوله…………………………………………………………………………50

3-6-3- مرحله شستشو……………………………………………………………………………………………..51

3-6-4- مرحله اضافه کردن محلول ید…………………………………………………………………………51

3-6-5- مرحله رنگ بری با استفاده از استن – الکل………………………………………………………51

3-6-6- رنگ آمیزی با فوشین…………………………………………………………………………………….51

3-6-7- خشک کردن لام……………………………………………………………………………………………51

3-6-8-نکات مهمی که هنگام رنگ آمیزی گرم باید مورد توجه قرار گیرد ………………………51

3-7- استخراج DNA………………………………………………………………………………………………52

3 -7-1- مواد و وسایل لازم……………………………………………………………………………………..52

3-8- آزمون PCR………………………………………………………………………………………………….. 52

3-8-1- مواد و وسایل لازم……………………………………………………………………………………….52

3-8-2- روش کار……………………………………………………………………………………………………53

3-9- الکتروفورز محصولاتPCR………………………………………………………………………………54

3-9-1- مواد و وسائل لازم……………………………………………………………………………………….54

3-9-2- تهیه بافر 1x………………………………………………………………………………………………..55

3-9-3- تهیه ژل آگاروز……………………………………………………………………………………………55

3-8-4- بارگذاری محصولات ……………………………….PCR…………………………55

3-10- مشاهده باند های روی ژل………………………………………………………………………………56

3-10-1- مواد و وسایل لازم…………………………………………………………………………………….56

فصل چهارم :نتایج

4-1 نتایج………………………………………………………………………………………………………………..58

4-2- کشت در محیط جامد انتخابی……………………………………………………………………………58

4-2-1- کشت در محیط XLD ………………………………………………………………………………..58

4-2-2-کشت در محیط سالمونلا شیگلا آگار……………………………………………………………….59

4-3-آزمون گرم………………………………………………………………………………………………………..59

4-4-تست های بیو شیمیایی…………………………………………………………………………………………..60

4-4-1-آزمون .TSI……………………………………………………………………………………………………..60

4-4-2-آزمون اوره آز………………………………………………………………………………………………….60

4-4-3-آزمون ..VP…………………………………………………………………………………………………61

4-4-5-آزمون اندول…………………………………………………………………………………………………….61

4-4-6-آزمون سیترات………………………………………………………………………………………………… 61

4-4-7-آزمون حرکت…………………………………………………………………………………………………..62

4-5-استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………..63

4-5-1-استخراج توسط KOH 5/0 مولار………………………………………………………………………63

4-6-آزمونPCR…………………………………………………………………………………………………………63

4 -7-نتایج آزمون کای دو……………………………………………………………………………………………67

فصل پنجم : بحث و پیشنهادات

5-1- بحث………………………………………………………………………………………………………………..69

5-2- نتیجه گیری نهایی………………………………………………………………………………………………77

5-3-پیشنهادات………………………………………………………………………………………………………….78

چكیده:

عفونت های سالمونلایی كه عفونت های غذایی نامیده می شوند، ممكن است توسط هر یك از سرووارها ایجاد شود. معمولا باكتری عامل عفونت در ماده غذایی رشد می كند تا به مقدار قابل توجهی برسد. به این ترتیب احتمال عفونت افزایش یافته و موجب بروز بیماری در خانواده ها و گروه های بزرگ می شوند. سالمونلا و سروتیپ های آن منبع مهم آلودگی های غذایی انسان و عامل پاتوژن بسیار قوی و بیماری زا در انسان هاست. سالمونلا باكتری گرم منفی، متحرك و باسیلی شكل است كه خصوصیات عمومی خانواده انتروباكتریاسه را داراست. امروزه بیش از 2450 سروتیپ سالمونلا شناسایی شده است كه برخی از این سروتیپ ها عامل بیماری هایی از قبیل تب تیفوئید و انتروكولیت در انسان می باشند. در این مطالعه 50 نمونه مدفوع افراد مبتلا به اسهال از سطح بیمارستان های شهرستان سبزوار جمع آوری گردید و با رعایت كامل موارد بهداشتی به آزمایشگاه تخصصی دانشگاه آزاد اسلامی واحد سبزوار منتقل شدند. برای جداسازی اولیه از محیط كشت های بافر پپتون واتر ، سلنیت F براث ،XLD و SS آگار استفاده گردید. جهت تایید تشخیص از تست های بیوشیمیایی نظیر TSI و اوره آگار و VP، اندول و سیمون سیترات و حرکت استفاده شد. در مطالعه حاضر 10 مورد باكتری سالمونلا با استفاده از روش كشت میكروبی جدا شد. این در حالی است كه با استفاده از روش مولكولی Multiplex PCR ، 21 مورد باكتری سالمونلا در نمونه ها ردیابی گردید. بنابراین می توان گفت كه روش PCR نسبت به كشت میكروبی از دقت بالاتری برخوردار است و همچنین روش های سنتی كشت میكروبی اغلب زمان بر خسته كننده و پرهزینه است.