1-7-1 تشخیص آزمایشگاهی باکتریShigella. 16

1-7-2 بیماری زایی.. 17

1-8Vibrio Cholerae. 17

1-8-1 شناسایی و طبقه بندی.. 18

1-8-2 فیزیولوژی.. 19

1-8-3عوامل موثر در بیماری زایی.. 19

1-8-4 تأیید بیوشیمیایی.. 19

1-8-4-1واکنش بر روی محیط TS یا KIA.. 20

1-8-4-2 تست­های دکربوکسیلاز- دهیدرولاز. 20

1-8-4-3 تست نیاز به نمک برای رشد. 20

1-8-4-4 حساسیت به ترکیب ویبریواستاتیک 129/O.. 20

1-9 رشد و نمو باکتریها 20

1-10 زمان تقسیم سلولی.. 21

1-11 مراحل رشد و منحنی رشد باکتریها 21

1-12 منحنی رشد باكتریایی.. 21

1-12-1 مرحله­ی خفته یا تاخیری (Lag phase) 22

1-12-2 مرحله ی فعال تکثیر یا رشد و تکثیر لگاریتمی (Logphase) 22

1-12-3 مرحله ی سکون یا تکثیر کند (Stationary phase)22

1-12-4 مرحله ی زوال یا مرگ (Deathphase) 23

1-13سرعت رشد و زمان نسل. 23

1- 14 محاسبه زمان نسل باکتری.. 23

1-15 شیوه های سنجش تعداد سلول. 24

1-16 محیطهای کشت.. 25

1-16-1محیط كشت مایع. 25

1-16-2 محیط كشت جامد. 25

1-17اهداف کلی.. 25

1-18 اهداف اختصاصی.. 25

1-19 پرسش­های تحقیق. 26

1-20فرضیه های تحقیق. 26

فصل دوم: سابقه و پیشینه

2-1 تاریخچه ترانسفورماسیون. 28

2-2 سیستم نوترکیبی مبتنی برλ-Red. 29

2-3 پلاسمید PKD₄₆30

فصل سوم: مواد و روش ها

3-1 دستگاه ها 32

3-2 موادشیمیایی.. 32

3-3 کیت­ها 32

3-4 میکروارگانیسم ها 32

3-5 كشت سویه انتخابی.. 32

3-6Transformation. 33

3-7 تهیه منحنی لگاریتمی.. 34

3-8 استخراج Total RNA.. 35

3-9 Reverse Transcriptase (RT-PCR) 36

3-9-1 طراحی پرایمرهای اختصاصی جهتReal-Time PCR.. 36

3-9-2 Real-Time PCR (RT-qPCR) 37

فصل چهارم: نتایج

4-1 استخراج Total RNA.. 40

4-2 نتایج Real-Time PCR.. 44

4-3 تایید پرایمرهای Real-Time PCR.. 45

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

5-1 بحث.. 48

5-2 محدودیت ها 52

5-3 پیشنهادات.. 52

فهرست منابع و مآخذ. 53

چکیده انگلیسی.. 56

چکیده

نوترکیبی همسان فرایندی است که در آن میتوان به تحریک ژنهای خاصی اقدام نمود که در نهایت با عملکرد جدید این ژنها میتوان یک ارگانیسم را به تولید یا عدم تولید یک پروتئین خاص وادار نمود. در حال حاضر تحقیقات گوناگونی وجود دارد که در آنها از نوترکیببی همسان استفاده می­شود. هرچقدر این روشها بهینه­تر گردند، مسلما فرایندهای اقدامات آزمایشگاهی را تسهیل خواهد نمود، در نوترکیبی همسان قطعه ای از محصول PCR به داخل کروموزوم باکتری وارد شده و با استفاده از وکتورهایλ-Redقادرخواهیم بود که ژنrecAرا در میزبان تحریک کرده ونوترکیبی همسان را به انجام برسانیم. درمطالعات قبلی نشان داده شده است که طول توالی­های انتهایی (flank) دو سر انتهای محصولPCR نقش مهمی در انجام نوترکیبی همسان دارد، ولی انتخاب طول flank طبق قاعده و قانون خاصی نیست و محقق باید بصورت آزمون و خطا این طول را انتخاب نماید. در مطالعات انجام شده بر سویه های استاندارد، طول این flank میتواند از 50 تا 2000 جفت باز متغیر می باشد.

در این مطالعه ابتدا باکتری های استانداردdysentrieaeShigella,E.coli, Vibrio Choleraeدر محیط غذایی کشت داده می­شود و سپس کلنی مساوی از هر یک از باکتری ها را انتخاب و جهت استخراج totalRNA به کار میرود. پس از تهیه total RNA آن را تبدیل به total cDNA می کنیم،. جهت تعیین وارزیابی بیان ژن l-Redاز تکنیک Real-timePCR با استفاده از SYBR greenІ و روش Relative استفاده نموده و میزان بیان ژنهای l-Red را در هر میزبان به دست خواهد داد. ژنهای l-Red ومیزان بیان آن در میزبان های متفاوت متغیر بوده و قطعا با ارزیابی بیان آن
می توان تا حدود زیادی طول مناسب را جهت نوترکیبی همسان تعیین کرد. در آن پایان نامه تلاش میگردد تا فرایند انجام نوترکیبی همسان در سویه های باکتریdysentrieaeShigella,E.coli, Vibrio Choleraeرا تسهیل نمود. به عبارتی قرار است بررسی گردد آیا نتایج بدست آمده باعث کمک به بهبود فرایند نوترکیبی همسان میشود یا خیر؟ و واضح است که هر چه میزان بیان ژنهای l-Red بیشتر باشد، بازده نوترکیبی همسان با طول کمتر flank نیز میسرتر است.

واژگان کلیدی: نوترکیبی همولوگ، ژن l-Red،dysentrieaeShigella,E.coli, Vibrio Cholerae

1-1 انتقال ژن در باکتری

در اكثر باكتری ها توراث ژنها اغلب به صورت عمودی است اما قسمت قابل توجهی از آن توسط انتقال جانبی یا عرضی بین باكتری ها انتقال می یابد. عناصر ژنتیكی متحرك مثل پلاسمیدها، باكتریوفاژها و ترانسپوزون ها به همراه تغییرات ژنی مثل حذف، اضافه شدن و ترتیب دوباره ژن ها سیر تكاملی پروكاریوتها را تسریع كرده اند و باعث ایجاد تغییرات در ژنوم باكتری ها و در نتیجه ایجاد تنوع ژنتیكی گردیده اند. باكتری ها با توجه به داشتن ژنوم كوچكتر نسبت به یوكاریوتها توانایی بیشتری برای به
اشتراك گذاشتن ژنوم­شان از طریق انتقال عرضی ژن توسط هم یوغی، ترانسداكشن[1] و ترانسفورمیشن[2] دارند. مهمترین فرآیند هم یوغی است كه طی تمـاس مستقیـم سلول با سلول اتفاق می­افتد
(Proter 1997; Burrus 2006).

هم یوغی امكان تغیرات ژنتیكی بین باكتریها و گاه حتی بین سلولهای یوكاریوتی را امكان پذیر
می سازد و اغلب توسط آن ژن های موجود بر روی « پلاسمیدهای كانژوگه» منتقل می شوند. ترانسداكشن نوع دیگری از انتقال افقی ژن است كه توسط ویروس ها و باكتریوفاژها صورت می پذیرد. بعضی از باكتریوفاژها می توانند به صورت یك پروفاژ به داخل كروموزوم باكتری میزبان وارد شده و باعث لیزوژنی آن شوند. پروفاژها قسمت مهمی از اكتساب افقی ژن را در DNA بسیاری از باكتریها به خود اختصاص داده اند. گاهی اوقات باكتریوفاژها باعث انتقال قسمت های متحرك دیگری از DNA باكتری و یا قسمتی دیگر از DNA ثابت باكتری می شوند و این زمانی اتفاق می افتد كه خروج فاژ به صورت دقیق صورت نگیرد. این مرحله ترانسداكشن تخصصی [3] نامیده می شود.

سومین نحوه انتقال ترانسفورمیشن است كه در آن DNA آزاد از محیط برداشته میشود. برای پایدار ماندن DNA وارد شده به ژنوم میزبان طی هر سه روش احتیاج به یك سری مراحل حمایت كننده مثل نوترکیبی یکسان[4] می باشد. همگان قبول دارند كه اكتساب توالی های جدید و توسعه ژنوم امری حیاتی برای تكامل میباشند. این که آیا ژن های اكتسابی در باكتری نگه داشته می شوند و یا این كه چگونه باقی
می مانند بستگی به عملكرد آن ژنها و فشار انتخابی محیط برای نگه داشتن آن دارد .( Proter 1997)

1-2 ترانسفورماسیون

ترانسفورماسیون یکی از راههای انتقال توارث به سایر باکتریها میباشد. در این روش یک تکه DNA دو رشته ای آزاد در محیط به سطح یک باکتری دیگر متصل شده و تنها یک رشته آن وارد باکتری شده و در کروموزوم باکتری میزبان ادغام می شود. برای داخل شدن قطعه ای از DNA در درون کروموزوم، عملکرد اپرونUVrABCD(UVدر اول اسم اپرون مخفف پرتوUVاست ) ژن rec A بر اثر عوامل مثل uv ، عوامل شیمیایی و ورودDNAتک رشته ای به درون باکتری فعال میشود وrABCDمخفف ژنهایrecA,recB,recCوrecDمیباشد) این اپرون شامل ژنهای recA,recB, recC وrecD میباشد. فرآیند نوترکیبی[5] بواسطه پروتئینRecAفعال میگردد. در این فرآیند، اگر DNAتک رشته ای وارد شده در باکتری، با ناحیه ای از کروموزوم تشابه داشته باشد، تعویض میگردد که این جابجایی بواسطه پروتئین RecA انجام
می پذیرد. از طرفی ژنهایrecB, recCوrecDنقش تنظیمی، با عملکرد منفی بر روی ژنrecAرا بازی میکنند(Hamood et al., 1986).

در حال حاضر، در آزمایشگاههای تحقیقاتی، با استفاده از این سیستم و نحوه ادغام فاژ λ وکتوری (وکتور ها مولکول های DNA ای هستند که برای کلون کردن قطعاتDNAدر سلول های میزبان به کار می روند) را تولید نموده اند که میزان نوترکیبی را در باکتریها افزایش میدهند. در این وکتور سه ژنexo,betوgamرا تحت یک پروموتری که با L-arabinose تحریک می شود قرار داده اند. عملکرد این سه ژن بدین صورت است که پروتئینExoباعث هضم نوکلئوتیدها از قسمت 5’ انتهای DNA دو رشته ای
می­شود و پروتئینBetبا حفاظت از قسمت تک رشته ای 3’ بوجود آمده، مانع تخریب آن میگردد. نهایتا پروتئینGamبا ممانعت از عملکرد ژنهایrecB,recCوrecDباعث تحریک بیان ژنrecAدر باکتریها می شود (شکل1-1).

مارکر مقاومت آنتی بیوتیکی در این وکتور آمپی سیلین بوده و از نظر تعداد پلاسمید در باکتریها، جزء پلاسمیدهای شمارش تکرار پایین[6]محسوب میگردد. بهترین دما، برای تکثیر این وکتور 30 درجه سانتیگراد بوده و در دمای 42-37 درجه سانتیگراد از دست میرود. بنابراین از این نظر، جزء پلاسمیدهای حساس به دما[7] نیز تقسیم­بندی میگردد (Yamamoto et al., 2009).مهمترین و کاربردی ترین پلاسمید در این زمینه pKD46 بوده که قابلیت تکثیر، درdysentrieaeShigella,E.coli, Vibrio Choleraeرا دارد.