………. 21

2-4- مکانیسمهای مقاومت به بیماری………………………………………………………………………. 23

1) مصونیت Immunity………………………………………………………………………………………………………… 23

2) فرار (Eascape)……………………………………………………………………………………………………………….. 23

3) تحمل (Tolerance)………………………………………………………………………………………………………….. 23

2-5- غربالگری برای ارقام مقاوم به بیماری……………………………………………………………………………………… 24

2-6- ارتباط بین مقاومت ارقام و میزان فومونسین……………………………………………………………………………. 30

فصل سوم: مواد و روشها

3- مواد و روش ها………………………………………………………………………………………… 32

3-1- نمونه برداری……………………………………………………………………………………….32

3-2- جداسازی، خالص سازی و نگهداری جدایه ها……………………………………………………………. 32

3-3- محیط کشت ها……………………………………………………………………………………. 33

3-3-1- محیط کشت سیب زمینی- دکتروز- آگار (P.D.A)………………………………………………….. 33

3-3-2- محیط کشت آب-آگار (W.A) Water Agar…………………………………………………………………… 33

3-3-3- محیط کشت برگ میخک- آگار (CL.A)…………………………………………………………………………… 33

3-3-4- محیط کشت کلرورپتاسیم (KCl)………………………………………………………………………………………. 34

3-3-5- محیط کشت Special Nutrient Agar (S.N.A)…………………………………………………………… 34

3-4- شناسایی گونه های فوزاریوم……………………………………………………………………………. 34

3-5- آزمون بیماریزایی……………………………………………………………………………………… 35

3-5-1- آزمون بیماریزایی در گلخانه……………………………………………………………………….. 35

الف- انتخاب جدایه ها و کشت بذرهای ذرت در گلخانه……………………………………………………. 35

ب) آماده سازی مایه تلقیح و مایه زنی ساقه های ذرت……………………………………………………… 35

ج) ارزیابی شدت بیماری (DS)……………………………………………………………………………… 37

3-5-2- آزمون بیماریزائی جدایه هایF. verticillioidesبر روی ساقه در مزرعه……………………….. 37

الف) انتخاب جدایه ها……………………………………………………………………………… 37

ب) تهیه مایه آلوده كننده و مایه زنی ساقه های ذرت……………………………………………………. 37

ج) ارزیابی……………………………………………………………………………………………. 38

3-5-3- آزمون بیماریزایی جدایه هایF. verticillioidesبر روی خوشه در مزرعه………………….. 39

الف: انتخاب جدایه ها…………………………………………………………………………….. 39

ب: تهیه مایه آلوده كننده و مایه زنی ساقه های ذرت…………………………………………………………… 39

ج: ارزیابی شدت بیماری و درصد آلودگی…………………………………………………………………….. 40

3-6- ارزیابی واكنش مقاومت ژنوتیپ های مختلف ذرت نسبت به عامل بیماری در مزرعه……………………. 40

الف) انتخاب جدایه ها و ژنوتیپ های ذرت…………………………………………………………………….. 41

ب) تهیه مایه آلوده كننده و مایه زنی بلالهای ذرت………………………………………………………….. 42

ج) ارزیابی شدت بیماری…………………………………………………………………………………………….. 43

3-7- بررسی میزان فومونیسین در ژنوتیپ های مختلف ذرت……………………………………………. 44

الف) نمونه برداری و آماده سازی نمونه ها برای آزمون ELISA………………………………………………………. 45

ب) مراحل استخراج فومونیسین كل……………………………………………………………………… 46

ج) انجام آزمون الایزا……………………………………………………………………………………….. 46

د) ارزیابی الایزا……………………………………………………………………………………………………… 47

فصل چهارم: نتایج و بحث

4- نتایج……………………………………………………………………………………………………… 50

4-1- جداسازی و شناسایی گونه های فوزاریوم………………………………………………………………. 50

الف) ویژگی های جدایه های قارچF. verticillioides(Sacc.) Nirenberg………………………………… 50

ب) ویژگی های جدایه های قارچF. proliferatum(Matsushima) Nirenberg………………………. 53

4-2- بررسی بیماریزایی جدایه های قارچF. verticillioidesبا روش مایه زنی ساقه در رقم حساس ذرت در گلخانه 55

4-3- بررسی بیماریزایی جدایه های قارچF. verticillioidesبا روش مایه زنی ساقه در مزرعه در روی لاین حساس MO17 57

4-4- بررسی تنوع بیماریزایی جدایه های قارچF. verticillioidesبا روش مایه زنی خوشه لاین حساس MO17 در مزرعه 60

4-5- ارزیابی واکنش مقاومت ژنوتیپ های مختلف ذرت نسبت به جدایه های مهاجم قارچ
F. verticillioidesدر مزرعه در منطقه ساری …………………………………………. 62

4-6- ارزیابی واکنش مقاومت ژنوتیپ های مختلف ذرت نسبت به مخلوط جدایه های مهاجم قارچ
F. verticillioidesبا دو روش مایه زنی ، تزریق با سرنگ و ایجاد زخم در بلال در مزرعه در منطقه کرج 66

4-7- ارزیابی واکنش مقاومت ژنوتیپ های مختلف ذرت نسبت به جدایه های مهاجم قارچ
F. verticillioidesبا روش مایه زنی ایجاد زخم در بلال در مزرعه در مناطق کرج و ساری ………………. 72

4-8- بررسی میزان تولید فومونیسین کل در ژنوتیپ های مختلف ذرت …………………. 75

فصل پنجم : بحث و نتیجه گیری

5 – بحث………………………………………………………….. 83

5-1- شناسایی گونه غالب عامل پوسیدگی خوشه ذرت ………………………………. 83

5-2- آزمون های بیماریزایی ………………………………………………………… 84

5-3- آزمون ارزیابی واکنش ژنوتیپ های ذرت به عامل پوسیدگی فوزاریومی بلال ……………………….. 85

5-4- آزمون بررسی تولید میزان فومونیسین کل ……………………………………………… 90

5-5- نتیجه گیری و پیشنهادات ……………………………………………………………………….. 93

منابع و مآخذ …………………………………………………………………………………………….95

چکیده

یکی از مهم ترین بیماریهای ذرت، بیماری پوسیدگی فوزاریومی بلال (Fusarium ear rot) می باشد که دارای پراکنش جهانی است. قارچ عامل بیماری عمدتاً گونهFusariumverticillioidesمی باشد، که باعث کاهش کمی و کیفی در عملکرد ذرت می شود. این بیماری در ایران در مناطق شمالی و ذرت خیز از بیماریهای مهم ذرت به شمار می رود.

در سال 1388، به منظور شناسایی عوامل بیماری و تعیین گونه غالب آن، از مزارع مختلف مناطق اصفهان، ساری، کرمانشاه و کرج از بلالهای آلوده نمونه برداری صورت گرفت.

پس از جداسازی و خالص سازی تعداد 40 جدایه فوزاریوم (32 جدایهF. verticillioidesو 8 جدایه
F. proliferatum( بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی و با استناد به کلیدهای معتبر قارچ شناسی مورد شناسایی قرار گرفت. بدین ترتیب قارچF. verticillioidesبا فراوانی %80 به عنوان گونه غالب عامل بیماری فوق و قارچF. proliferatumeبا فراوانی %20 به عنوان گونه دوم عامل بیماری معرفی شدند. بیماریزایی گونه های شناسایی شده طی آزمونهای گلخانه ای و مزرعه ای به اثبات رسید. نتایج حاصل از آزمایشات بیماریزایی جدایه ها نشان داد که جدایه هایF. verticillioidesدارای قدرت بیماریزایی متفاوتی می باشند، و در گروههای مختلف قرار گرفتند. نتایج حاصل از این بررسی ها نشان داد که بین دو آزمایش گلخانه و مزرعه همبستگی نسبتاً پائینی r=0.45) ( وجود دارد . در این بررسی مقاومت 10 ژنوتیپ مختلف ذرت با دو روش مایه زنی، ایجاد زخم در بلال (Nail Punch) و تزریق در نوک بلال (Tip injection) در دو منطقه ساری و کرج مورد ارزیابی قرار گرفت. به منظور این بررسی از مخلوط هشت جدایه برتر
F. verticillioidesکه در آزمون گلخانه ای بیماریزایی بیشتری داشتند به عنوان مایه تلقیح با غلظت 10⁶اسپور در هر میلی لیتر استفاده شد. نتایج حاصل از این بررسی نشان داد که ژنوتیپ ها از نظر حساسیت به بیماری پوسیدگی فوزاریومی بلال با همدیگر متفاوت بوده و لاین K18 در هر دو منطقه در مقایسه با لاین ها از مقاومت بهتری برخوردار بوده است. نتایج بررسی تولید مایکوتوکسین فومونیسین کل در ژنوتیپ ها ی مختلف ذرت که توسط ELISA در دو منطقه ساری و کرج صورت گرفت، سطوح مختلفی از فومونیسین کل را در بین ژنوتیپ های مختلف ذرت نشان داد. نتایج حاصل از بررسی میزان حساسیت به بیماری و میزان تجمع فومونسین حاکی از آن است که مابین مقاومت ژنوتیپ ها و میزان تجمع فومونسین رابطه ای مستقیم وجود دارد بطوریکه لاین K18 به عنوان ژنوتیپ مقاوم با کمترین میزان فومونیسین در هر دو منطقه مشاهده گردید .، و لاین K19 به عنوان حساس ترین ژنوتیپ با بیشترین میزان فومونیسین شناخته شد.

کلمات کلیدی: ذرت، شناسایی، فوزاریوم، مقاومت، فومونیسین.

مقدمه و کلیات

ذرت یکی از مهمترین گیاهان زراعی است که در اکثر کشورهای جهان کشت می شود. این گیاه به عنوان سلطان غلات معروف است، زیرا ارزش آن در جهان از گندم، جو، یولاف و برنج بیشتر است. ذرت به دلیل داشتن تنوع و کیفیت و عادات رشد مختلف به عنوان یکی از بهترین گیاهان زراعی مورد استفاده قرار می گیرد. ذرت یکی از پرمحصول ترین غلات بشمار می رود و از لحاظ مقدار کل تولید بعد از گندم و برنج سومین محصول غله ای جهان است. تولید غذا برای جمعیت روز افزون جهان مهمترین مشكل جوامع بشری است. غذای اصلی انسان اغلب از فرآورده های گیا هان تیره غلات بویژه گندم ،برنج و ذرت تامین می گردد.

طبق آمار سازمان خواربار جهانی (FAO) در كشورهای توسعه یافته 78% ازذرت تولیدی برایتغذیه داموفقط 6% به عنوان غذای انسان استفاده می شود و مابقی مصرف صنعتی دارد. در حالیكه در كشورهای درحال توسعه 50% به عنوان علوفه و40% به طور مستقیم صرف تغذیه انسان و باقیمانده آن برای مصارف صنعتی یا جهت بذر به صورت واریته های آزاد گرده افشان بكار می رود (Anonymous, 2006). با توجه به اهمیت ذرت در تغذیه دام و طیور و همچنین قدرت تطابق و سازگاری این گیاه با شرایط اقلیمی متفاوت و استفاده از بذر هیبرید و مكانیزه شدن كشت ذرت طی سالهای اخیر، سطح زیر كشت و متوسط عملكرد آن در واحد سطح در كشور افزایش قابل توجهی پیدا نموده است .اصلاح ذرت در جهت افزایش عملكرد دانه، علوفه سیلویی و مقاومت در برابر آفات و بیماریهای گیاهی بر پایه اصلاح جمعیت ها و تولید واریته های هیبرید می باشد. در این راستا لازم است صفاتی كه به طور مستقیم و یا غیر مستقیم روی عملكرد موثر هستند شناسایی گردد و نقش هر یک از این صفات در عملکرد مشخص گردد. عوامل متعددی مانند آفات و بیماریها باعث کاهش عملکرد می شوند. پوسیدگی بلال ذرت یکی از مهم ترین بیماریهای ذرت در سراسر دنیا بخصوص در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری می باشد. این بیماری هر ساله علاوه بر خسارات کمی خسارات کیفی نیز به بار می آورد. بیماری در مزرعه قادر است تا95% محصول را خسارت بزند
(Jeffereet al.,1994).

بروز این بیماری در قاره های امریکا، اروپا، اسیا، افریقا گزارش شده است (MCGee, 1988). در ایران این بیماری در مناطق شمالی کشور مانند گرگان، ساری و بندرانزلی گزارش شده است (مهریان وبامدادیان، 1369). پوسیدگی بلال عمدتاً با دانه های آلوده و پراکنده ای که با میسلیوم سفید مایل به صورتی پوشیده است مشخص می گردد (Farrar & Davis, 1991). در سالهای اخیر نقش این بیماری با توجه به توکسین هایی که توسط گونه های مختلفF. verticillioides،F. proliferatim،
F. moniliformeوFusariumnyganaiتولید می شوند در کاهش کیفیت ذرت و ایجاد مسمومیت در انسان و دام نقش ویژه ای دارد (Leslie & Summerell, 2006). فومونیسین ها گروه خاصی ازمایکوتوکسین ها هستند که عمدتاً در ذرت و فراوردهای آن ایجاد می شوند. با توجه به اینکه برای مبارزه با هر بیماری شناخت بیمارگر ضروریست و عدم توفیق در کنترل بیماری نتیجه عدم درک و شناخت پاتوژن می باشد، بنابراین شناسایی گونه های مختلف عامل بیماری و بررسی میزان فومونیسین مترشحه آنها در مدیریت بیماری و تضمین سلامت غذایی مصرف کنندگان بسیار مهم می باشد. لذا بررسی دقیق و انجام تحقیق در ارتباط با میزان توکسین قارچ و احتمال کاهش آن با بهره گیری از ژنوتیپ های مقاوم در مناطق شیوع بیماری ضروری بنظر می رسد. یکی از مهمترین راههای کنترل این بیماری و کاهش میزان مایکوتوکسین های مضر مترشحه قارچ عامل بیماری، شناسایی و دستیابی به ارقام مقاوم می باشد که تنها از طریق آلوده سازی به طور مصنوعی در مزارع و طی چند سال بدست می آید. در این تحقیق پس از تعیین تنوع بیماریزایی جدایه های قارچ عامل بیماری، ژنوتیپ های مختلف ذرت از نظر میزان مقاومت به بیماری سنجیده شده و اینکه آیا ارتباطی بین مقاومت به قارچ عامل بیماری و میزان فومونیسین کل تولید شده وجود دارد یا خیر مورد بررسی قرار می گیرد. کاربرد نتایج این تحقیق در برنامه های اصلاحی جهت تولید ارقام مقاوم ذرت با میزان فومونیسین پایین و هیبریدهای متحمل به بیماری پوسیدگی فوزاریومی خوشه یا بلال باعث افزایش کمی و کیفی محصول در مزارع زیر کشت خواهد شد و از نظر ارتقای سلامت غذایی در مصرف کنندگان می تواند بسیار با اهمیت و ارزشمند باشد. این تحقیق جهت نیل به اهداف عمده زیر طرح ریزی و انجام گردید.

1 – شناسایی قارچ عامل پوسیدگی فوزاریومی خوشه ذرت و تعیین گونه غالب عامل بیماری

2- بررسی تنوع بیماریزایی جدایه های قارچ عامل بیماری

3- ارزیابی ژنوتیپ های ذرت از نظر میزان مقاومت به بیماری

4- ردیابی و تعیین میزان تولید فومونیسین کل در ژنوتیپ های مختلف ذرت

5- ارتباط بین میزان تولید فومونیسین کل و میزان مقاومت به بیماری پوسیدگی فوزاریومی ذرت در ژنوتیپ های تحت بررسی.