………………………….

4

1-1-1 اهمیت موضوع…………………………………………………………………………………………………

4

1-1-2 فرضیات………………………………………………………………………………………………………….

5

1-1-3 اهداف پژوهش…………………………………………………………………………………………………

5

1-1-4 ساختارپژوهش…………………………………………………………………………………………………

6

1-2 کلیات………………………………………………………………………………………………………………….

6

1-2-1 گیاه شناسی……………………………………………………………………………………………………..

7

1-2-2 رویش و تکثیر گیاه…………………………………………………………………………………………..

7

1-2-3 خواستگاه و دامنه انتشار…………………………………………………………………………………….

7

1-2-4 نیازهای اکولوژی………………………………………………………………………………………………

8

1-2-5 اهمیت دارویی…………………………………………………………………………………………………

8

1-2-6 مواد موثره و اجزاء اسانس…………………………………………………………………………………

9

1-2-7 استفاده ها…………………………………………………………………………………………………………

9

1-2-8 کشت بافت گیاهی……………………………………………………………………………………………

11

1-2-8-1 تاریخچه کشت بافت گیاهی…………………………………………………………………………..

12

1-2-9 کاربردهای کشت بافت گیاهی…………………………………………………………………………….

12

1-2-9-1 تولید مواد شیمیایی……………………………………………………………………………………….

12

1-2-9-2 ایجاد گیاه عاری از عوامل بیماری زای گیاهی……………………………………………………

12

1-2-9-3 ایجاد تنوع ژنتیکی………………………………………………………………………………………..

12

1-2-9-4 کاربرد کشت بافت گیاهی در کشاورزی،باغبانی و جنگل داری…………………………….

13

1-2-9-5 کاربردهای اقتصادی کشت بافت گیاهی…………………………………………………………..

13

1-2-9-6 کاربردهای کشت بافت گیاهی در مهندسی ژنتیک و فناوری زیستی…………………….

صفحه

عنوان

14

1-2-9-7 انواع کشت بافت گیاهی………………………………………………………………………………..

14

1-2-9-8 بررسی اثرات فاکتورهای مختلف در محیط کشت…………………………………………….

15

1-2-9-9 نمک های غیرآلی………………………………………………………………………………………….

15

1-2-9-10 ویتامین ها…………………………………………………………………………………………………..

16

1-2-9-11 هورمون های گیاهی…………………………………………………………………………………….

16

1-2-9-11-1 اکسین ها………………………………………………………………………………………………..

17

1-2-9-11-2 سیتوکنین ها……………………………………………………………………………………………

18

1-2-9-12 منبع انرژی…………………………………………………………………………………………………

18

1-2-9-13 عوامل فیزیکی……………………………………………………………………………………………

18

1-2-9-14 مواد آلی…………………………………………………………………………………………………….

19

1-2-9-15 ریزنمونه……………………………………………………………………………………………………

19

1-2-9-16 PH………………………………………………………………………………………………………….

19

1-2-9-17 آب…………………………………………………………………………………………………………..

20

1-2-9-18 آگار………………………………………………………………………………………………………….

20

1-2-9-19 چگونگی انتخاب محیط کشت……………………………………………………………………..

20

1-2-10 ریزازدیادی گیاهان از طریق کشت بافت…………………………………………………………….

21

1-2-10-1 موارد استفاده از ریزازدیادی…………………………………………………………………………

22

1-2-11ریشه زائی………………………………………………………………………………………………………..

22

1-2-12 تعریف موتاسیون (جهش)……………………………………………………………………………….

22

1-2-12-1 تاریخچه استفاده از موتاسیون……………………………………………………………………….

23

1-2-12-2 انواع موتاسیون…………………………………………………………………………………………..

23

1-2-12-3 موتاژن………………………………………………………………………………………………………

24

1-2-12-3-1 انواع موتاژن…………………………………………………………………………………………..

24

1-2-12-3-2 عوامل شیمیایی جهش زا…………………………………………………………………………..

25

1-2-12-4 سطوح ایجاد موتاسیون………………………………………………………………………………..

صفحه

عنوان

26

1-2-12-5 مواد گیاهی مورد تیمار………………………………………………………………………………..

26

1-2-12-6 اهمیت موتاسیون در اصلاح نباتات……………………………………………………………….

26

1-2-12-7 هدف موتاسیون مصنوعی…………………………………………………………………………….

27

1-2-12-8 موفقیت موتاسیون………………………………………………………………………………………

27

1-2-12-9 اصلاح به روش موتاسیون……………………………………………………………………………

27

1-2-12-10 روش های جدید استفاده از موتاسیون………………………………………………………….

28

1-2- 13اسانس گیاهی…………………………………………………………………………………………………

29

1-2-13-1روغن های اسانس………………………………………………………………………………………..

30

1-2-13-2 جداسازی و شناسایی مواد تشکیل دهنده روغن اسانسی گیاه……………………………

فصل دوم:ی بر تحقیقات انجام شده

31

2-1 اثر موتاژن ها در ایجاد تنوع در صفات مختلف………………………………………………………….

33

2-2 اثر موتاسیون اتیل متیل سولفانات در ایجاد تنوع در سطوح مختلف……………………………..

38

2-3 کشت بافت………………………………………………………………………………………………………….

فصل سوم: مواد و روش ها

40

3-1 مواد گیاهی…………………………………………………………………………………………………………..

40

3-2 کشت بافت………………………………………………………………………………………………………….

40

3-2-1 تهیه محلول ذخیره محیط های کشت……………………………………………………………………

41

3-2-1-1 تهیه محلول ذخیره ماکرو……………………………………………………………………………….

41

3-2-1-2 تهیه محلول ذخیره عناصر میکرو…………………………………………………………………….

43

3-2-1-3 تهیه محلول ذخیره آهن-سدیم……………………………………………………………………….

43

3-2-1-4 تهیه محلول ذخیره ویتامین…………………………………………………………………………….

44

3-2-2 تهیه محیط کشت………………………………………………………………………………………………

45

3-2-3 کار در اتاقک کشت بافت…………………………………………………………………………………..

46

3-2-4 ضدعفونی وسایل آزمایشگاهی، محیط کشت و مواد گیاهی……………………………………

46

3-2-4-1 ضدعفونی نمونه های گیاهی……………………………………………………………………………

صفحه

عنوان

46

3-2-3-1 ضدعفونی اندام گیاه……………………………………………………………………………………..

47

3-2-5 تهیه ریزنمونه……………………………………………………………………………………………………

47

3-2-6 بهینه سازی محیط کشت……………………………………………………………………………………

47

3-2-7 بررسی نمونه های کشت شده…………………………………………………………………………….

47

3-2-8 بازیافت کشت های آلوده……………………………………………………………………………………

48

3-2-9 تیمارهای مورد استفاده………………………………………………………………………………………

48

3-2-9-1 روش تهیه استوک EMS …………………………………………………………………………….

49

3-2-9-2 روش اعمال تیمارهای EMS در گیاه کشت بافتی……………………………………………

49

3-2-9-3 روش اعمال تیمارهای EMS در مزرعه………………………………………………………….

50

3-2-9-4 روش شستشوی تیمارها………………………………………………………………………………..

50

3-3 تهیه مواد گیاهی برای اسانس گیری………………………………………………………………………….

50

3-4 آنالیز اجزاء اسانس………………………………………………………………………………………………..

51

3-5 تجزیه داده های آماری……………………………………………………………………………………………

فصل چهارم: نتایج و بحث

52

4-1 کشت بافت………………………………………………………………………………………………………….

55

4-2 تاثیر EMS برروی خصوصیات مرفولوژیکی گیاه…………………………………………………….

56

4-2-1 ضریب همبستگی بین صفات و خصوصیات مورد بررسی……………………………………..

56

4-2-2 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه جانبی………………………………………………….

57

4-2-3 اثر دوز EMS و زمان برروی طول ریشه…………………………………………………………….

57

4-2-4 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد ریشه……………………………………………………………

58

4-2-5 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد برگ…………………………………………………………….

58

4-2-6 اثر دوز EMS و زمان برروی تعداد جوانه…………………………………………………………..

59

4-2-7 اثر دوز EMS و زمان برروی طول ساقه……………………………………………………………..

60

4-2-8 اثر دوز EMS و زمان برروی متوسط طول برگ………………………………………………….

60

4-3 استخراج اسانس……………………………………………………………………………………………………

صفحه

عنوان

60

4-3-1 آنالیز و شناسایی کمی و کیفی اجزای موجود در اسانس…………………………………………

61

4-3-2 نتایج مربوط به طیف کروماتوگرام گازی گیاه……………………………………………………….

62

4-3-3 ترکیبات تشکیل دهنده اسانس……………………………………………………………………………

فصل پنجم: نتیجه گیری

63

5-1 بحث…………………………………………………………………………………………………………………..

63

5-1-1 کشت بافت گیاهی……………………………………………………………………………………………

64

5-1-2 اثرات موتاژن EMS ……………………………………………………………………………………….

68

5-2 نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………..

69

5-3 پیشنهادات……………………………………………………………………………………………………………

70

فهرست منابع فارسی…………………………………………………………………………………………………….

74

فهرست منابع انگلیسی………………………………………………………………………………………………….

86

چکیده انگلیسی……………………………………………………………………………………………………………

چکیده

بادرنجبویه با نام علمیMelissa officinalisیکی از انواع گیاهان دارویی می باشد که به دلیل تولید اسانس های با ارزش در صنایع داروسازی و بهداشتی استفاده های فراوانی دارد. این پژوهش با قرار دادن ریز نمونه های بادرنجبویه به محیط کشت درون شیشه ای MS انجام شد و هدف تکثیر گیاه از طریق کشت بافت برای استفاده از تاثیر موثرتر ماده جهش زا و بدست آوردن نمونه های گیاهی جدید موتانت شده هم از طریق کشت بافت و هم در محیط مزرعه و بررسی تغییرات میزان مواد موثره اسانس موجود در گیاه در اثر ماده جهش زای اتیل متیل سولفانات (EMS) می باشد. این آزمایش هم بصورت مزرعه ای و هم بصورت آزمایشگاهی (کشت بافتی) مورد بررسی قرار گرفت. در تیمارهای آزمایشگاه، سرشاخه های رشد یافته در محیط MS بدون هورمون را با غلظت های 0/0% (به عنوان شاهد)، 05/0% و 01/0% و 005/0% EMS و در مدت زمان های 24 و48 ساعت اعمال شدند. در قسمت مزرعه ای نیز از همین غلظت ها و زمان ها استفاده شدند. فاکتورهای مختلفمورفولوژیکاز قبیل طول ساقه، طول ریشه، تعداد جوانه در ساقه، تعداد ریشه رونده جانبی، طول برگ و تعداد برگ در ساقه مورد ارزیابی قرار گرفته و پاسخ معنی داری را در سطح 5 درصد نشان دادند این آزمایش نشان داد كه استفاده از مواد جهش زا در محیط کشت MS نقش بسزایی در تغییر مرفولوژیک این گیاه دارویی دارد. بهترین نتیجه نیز از کشت ریزنمونه های که شامل جوانه های جانبی و انتهایی بوده اند و تحت تیمار با غلظت 01/0% EMS بودند به دست آمد. آنالیز اسانس تیمارها نیز انجام شد که نتیجه آن بی اثر بودن این ماده اتیل متیل سولفانات روی مواد اجراء اسانس این گیاه بوده است.

کلمات کلیدی: بادرنجبویه (Melissaofficinalis)، کشت درون شیشه ای، محیط کشت MS، اتیل متیل سولفانات(EMS)، مواد موثره

1-1 مقدمه:

گیاهان دارویی فراوانی در کشور ما می رویند که بسیاری از آن ها دارای طیف وسیعی از خواص دارویی می باشند و در بسیاری از نقاط کشور رشد می یابند. برهمین اساس بررسی و مطالعه گیاهان دارویی ایران با استفاده از ابزارهای امروزی ضروری به نظر می رسد. در حال حاضر در قرن 21، طب گیاهی از جایگاه خاصی برخوردار است به گونه ای که در اتحادیه اروپا قوانینی مبنی بر لزوم انجام آزمایشات بالینی برروی گیاهان دارویی همانند داروهای شیمیایی وضع کرده است که بر اساس آن تمام داروهای گیاهی باید مجوز دریافت نمایند. اولین استفاده از گیاهان دارویی در خاورمیانه و مربوط به عصر پارینه سنگی است. شواهد استفاده از گیاهان دارویی توسط انسان به حدود شصت هزار سال پیش می رسد.

گیاهان به عنوان یکی از اجزاء طبیعت، از دیرگاه پشتوانه غنی نیازهای بشری بوده اند و می توان با اطمینان گفت تا زمانی که انسان در این کره خاکی به سر می برد، به گیاهان نیاز دارد (سلیمان زاده، 1377).

در بحث گیاهان دارویی، محدودیت های کاشت و نگهداری آن ها متعدد می باشد که از آن جمله می توان به کوتاه بودن فصل کاشت و یا برداشت بعضی از گونه های گیاهی، کمبود زمین های مناسب جهت داشت، ناچیز بودن مواد موثره حاصل از گیاه و غیره اشاره کرد (ثقه الاسلام و موسوی، 1385).

یکی از راه های رفع این محدودیت ها کشت بافت گیاهی[1] است. تکنیک های کشت بافت گیاهی درحال حاضر به عنوان یک ابزار قوی جهت رفع مشکلات اساسی و کاربردی بیولوژی گیاهی درآمده است.

استفاده از گیاهان به عنوان دارو از زمان های خیلی دور در معالجه انسان و دام مرسوم بوده است. در حال حاضر حدود یک سوم داروهای مورد استفاده دارای منشاء گیاهی می باشند. کشورهای آسیایی بخصوص هند، چین و ایران سابقه بسیار طولانی دراین زمینه دارند. این گیاهان مواد زیستی بخصوص و فعال با مقادیر بسیار کم تولید می کنند که تحت عنوان متابولیت های ثانویه نام گذاری می شوند.در عصر جدید، دانشمندان علوم گیاهی با استفاده از آخرین تکنیک های عملی کشت بافت گیاهی، توانسته اند از انواع گیاهان ترکیب های بسیار مفیدی را جهت مداوای بیماری های سخت و غیر قابل مداوا و موارد استفاده دیگر، بدست آورند. در طی چند دهه اخیر روش‎های متفاوتی با استفاده از بیوتکنولوژی[2] درزمینه پرورش محصولات گیاهی برتر ابداع شده است که از جمله آن ها می توان روش های ایجاد گونه های جهش یافته[3] و پلی پلوئید[4] را نام برد.

کشت سلول و بافت که به عنوان کشت درون شیشه ای[5] و یا کشت استریل نیز مطرح می شود، ابزاری مهم در مطالعات پایه و کاربردی بوده و دارای کاربردهای تجاری است (رجب بیگی و همکاران، 1385؛ سونانداکوماری و همکاران[6]، 2003). یکی از این کاربردها امکان ایجاد گیاهان ترانسژنیک با وارد کردن DNA تقریبا از هر منبع دیگری می باشد. شاید اولین قدم در زمینه کشت بافت گیاهی در سال 1756 توسط هنری لوئیس داهامل برداشته شد، زمانی که وی شاهد تشکیل کالوس[7] در حین مطالعه مواد التیام دهنده زخم های گیاهی بود (غضنفری[8]، 1994).

اساس تئوری کشت بافت گیاهی توسط گتلیت هابرلنت از آکادمی علوم آلمان در سال 1902، بعد از آزمایش های وی روی کشت تک سلول ها پیشنهاد گردید (هابرلنت[9]، 1902). توسعه روش های کشت بافت و زیست شناسی مولکولی برای تبادل DNA بین موجودات زنده غیر خویشاوند این امکان را می دهد که ژن های جدیدی از موجودات زنده خارج از سلسله گیاهی به درون گیاهان گیرنده وارد شوند. لذا مطالعه حاضر می تواند کمکی جهت بررسی و واکنش های گیاه بادرنجبویه نسبت به تکنیک های مختلف کشت بافت و باززائی این گیاه از طریق کشت بافت و اثر مواد جهش زائی همچون اتیل متیل سولفانات[10] (EMS) باشد، تا محققین دیگر بتوانند به مطالعه خواص دارویی یا تغییرات لازم در مواد موثره یا فعال (متابولیت های ثانویه) و یا مطالعات انتقال ژن در این گیاه بپردازند.

1-1-1 اهمیت موضوع

برای انجام کشت بافت بادرنجبویه (Melissa officinalisL) از بخش های مختلف گیاه مانند ریشه، برگ، ساقه و گره استفاده شد (سونانداکوماری و همکاران، 2003؛ ساجانا و همکاران[11]، 2011). با توجه به اینکه روش معمول اصلاح و بهبود تولید متابولیت های ثانویه در گیاهان دارویی شامل کاشت آن ها در مزرعه و سپس برداشت و استخراج این مواد به روش های شیمیایی و غیره با مشکلات متعددی نظیر شرایط محیطی و زراعی، صرف زمان، هزینه و استفاده نیروی کار زیاد و همچنین خطرنابودی برخی از گیاهان دارویی کمیاب روبرو است، استفاده از روش های نوین از جمله کشت درون شیشه ای (invitro) ضرورت می یابد به همین منظور اولین بار در سال 1976 توسط زنیک تکنیک کشت سوسپانسیون سلول های گیاهی حاوی متابولیت های ثانویه انجام گرفت. البته در ارتقاء بیوسنتز متابولیت های دارویی در شرایط درون شیشه ای اغلب، گیاهانی انتخاب می شوند که بازده تولید متابولیت های با ارزش در آن ها بالا باشد (باقری و صفاری، 1387).

بادرنجبویه به عنوان یک گیاه دارویی شناخته می شود (امیدبیگی ،1386؛ هوشیار قیصر،1388). تاکنون مطالعات زیادی در مورد تعیین مواد موثره بادرنجبویه صورت گرفته است (رجحان،1362؛ زرگری،1369؛ مومنی وشاهرخی،1377؛ آزادبخت،1378). موارد مصرف و خواص دارویی آن نیز به خوبی مطالعه شده است اما مطالعات کشت بافت و ایجاد جهش زیاد نبوده است. همچنین با در نظر گرفتن اهمیت و خواص دارویی این گیاه، مطالعات کشت بافت، بهینه سازی محیط کشت جهت اهداف مختلف، مطالعه متابولیت های ثانویه ،انتقال ژن و مهندسی ژنتیک برای این گیاه ضرورت دارد.

1-1-2 فرضیات