1-2-8-4-1 آنزیم DNA جیراز 16

1-2-8-4-1-1 نقش آنزیم DNA جیراز سلول های باکتریایی. 17

1-2-8-5 مقاومت به فلوروکینولون ها 17

1-2-8-5-1 موتاسیون در ژن های شیگلا. 18

1-2-8-5-2 تغییرات در توپوایزومراز IV.. 18

1-2-8-5-3 مقاومت وابسته به پلاسمید. 19

1-2-8-5-4 کاهش جذب و تغییرات در افلوکس پمپ ها 20

1-2-8-5-5 تغییرات در غشاء خارجی. 20

1-2-9 عوارض فلوروکینولون ها 20

1-3 اهداف تحقیق. 21

1-3-1 هدف کلی تحقیق. 21

1-3-2 اهداف جزئی تحقیق. 21

1-3-3 هدف کاربردی. 21

1-3-4 فرضیات.. 22

3-6 تعاریف واژه ها 22

فصل دوم:ی بر تحقیقات انجام شده

2-1ی بر تحقیقات انجام شده 23

فصل سوم:مواد وروش ها

3-1- دستگاه ها، تجهیزات و مواد مورد استفاده 26

3- 1- 1- فهرست وسایل به کار گیری شده 26

3- 1- 2- فهرست مواد به کار گیری شده 27

3- 1- 3- ترکیبات و محلول های مورد نیاز و فرمول ساخت.. 27

3-2- روش مطالعه و اجرای طرح. 28

3- 2- 1- نوع مطالعه 28

3- 2- 2- جامعه مورد مطالعه 28

3- 2 – 3- تعداد نمونه های مورد استفاده 28

3-2–4- روش تجزیه و تحلیل داده ها 28

3- 2- 5- ملاحظات اخلاقی. 29

3- 2- 6- مشکلات و محدودیت ها 29

3- 2 – 7- جمع آوری اطلاعات بیماران. 29

3- 3- انجام امور باکتریولوژیک.. 29

3- 3 – 1-کشت، جداسازی و تعیین هویت باکتریها 29

3- 3 – 2-بررسی حساسیت آنتی بیوتیکی. 30

3- 3 – 3- روش تعیین حساسیت باکتری ها نسبت به آنتی بیوتیک.. 30

3- 3 -3- 1-تهیه ی محیط کشت.. 30

3- 3 -3- 2-تهیه ی سوسپانسیون میکروبی. 30

3- 3 -3- 3-مرحله دیسک گذاری. 31

3- 4- انجام آزمایشات مولکولی. 31

3- 4 – 1- استخراجDNA باکتری. 31

3- 4 – 1- 1-کشت.. 31

3- 4 – 1- 2- جداسازی رسوب باکتری. 31

3- 4 – 1- 3- نگه داری DNA استخراج شده 32

3- 4 – 1- 4- اندازه گیری مقدار DNA استخراج شده 33

3- 4 – 2- پرایمر های مورد استفاده جهت شناسایی ژنهایgyrA. 33

3 -4-2–1- طراحی و سنتز پرایمر و بررسی کیفیت پرایمر ها 33

3-4-3- PCR.. 34

3-4-3-1-گرادیانت دمایی جهت بدست آوردن دمای اتصال. 34

3-4–3-1- بررسی جهش ای احتمالی بر روی ژنgyrAبا استفاده ازPCR-RFLP پرایمر (L وD) 38

3-4–4- الکتروفورز 39

3-4-4–1- الکتروفورز محصول PCR.. 39

3-4-4–2- رنگ آمیزی ژل و عکس برداری. 39

3-4-5- ترادف یابی. 40

فصل چهارم:نتایج تحقیق

4- 1- نتایج کشت جداسازی و تعیین هویت باکتری ها و اطلاعات مربوط به بیماران. 41

4-2- فراوانی بیماران بر اساس سن و سال و جنس… 42

4-3- نتایج مربوط به توزیع سرو گروه های شیگلا. 43

4-4- نتایج مربوط به حساسیت آنتی بیوتیکی. 44

4-5- نتایج آزمون PCR برای شناسایی ژنgyrAدر سویه های مقاوم نسبت به نالیدیکسیک اسید. 46

4-6- انجام آزمون روی سایر ایزوله ها توسط Primer L. 48

4-7- بررسی جهش های احتمالی بر روی ژنgyrAبا استفاده از PCR-RFLP. 52

4-8- انجام آزمون روی سایر ایزوله ها توسط Primer D.. 57

4-9- بررسی جهش های احتمالی بر روی ژنgyrAبا استفاده از PCR-RFLP. 61

4 – 10- نتایج مربوط به بررسی وجود ژنهایqnrA،qnrB،qnrSدر نمونه های بالینی شیگلا. 65

4 – 11- نتایج تعین توالی. 68

فصل پنجم:بحث و نتیجه گیری

5-1 بحث و نتیجه گیری. 74

منابع فارسی و لاتین. 82

چکیده

شیگلوزیس بطور شایعی مربوط به کودکان بوده به طوری که در اغلب موارد عفونت را کودکان کمتر از پانزده سال سن تشکیل می دهند. فلوروکینولون­ها بطور موفقیّت آمیزی برای درمان شیگلوزیس، از جمله عفونت­های ناشی از سویه­های با مقاومت چند گانه آنتی بیوتیکی استفاده می­گردند. اما بهزمان سویه های مقاوم آنتی بیوتیکی به وجود آمده است، اهمیّت این موضوع به این دلیل است که مصرف بی رویه و غیر منطقی آنتی بیوتیک بدون توجه به الگو های مقاومتی می تواند باعث ظهور سویه هایی شود که حتی به درمان های جدید نیز مقاومت داشته باشند و ظهور سویه های جدید مقاوم به نالیدیکسیک اسید روشن کننده این واقعیّت می باشد. بنابراین بررسی مولکولی این نوع مقاومت ها بسیار حائز اهمیّت خواهد بود. گزارشات در خصوص بروز سویه­های شیگلا مقاوم به فلوروکینولون­ ها محدود است. لذا مطالعه حاضر با هدف بررسی فراوانی موتاسیون­های ژنgyrAژن­های و وجودqnrدر سویه­های شیگلا های جدا شده از بیماران مبتلا به شیگلوز در تهران انجام گردید. در مجموع 73 سویه شیگلا جدا شده از موارد بالینی در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفت. سویه­های شیگلا با استفاده از روش­های استاندارد میکروبیولوژیک جداسازی و تعیین هویت گردیدند. تست حساسیت آنتی بیوتیکی و غربالگری سویه­های شیگلا مقاوم به فلوروکینولون­ها مطابق با دستورالعمل­های استاندارد CLSI انجام پذیرفت. حضور ژن­­هایqnrاز جملهqnrA،qnrBوqnrSتوسط تکنیک PCR با استفاده از پرایمر­های اختصاصی مورد بررسی قرار گرفت. همچنین تکثیر از لوکوس ژنتیکی ناحیه مقاومت کینولونی ژنgyrAبا استفاده از PCR انجام پذیرفت. سپس موتاسیون­های ژنgyrAتوسط تکنیکRFLP و با استفاده از آنزیم محدود الاثر HinfI تعیین گردید. تمام آمپلیکون­های مربوط به نمونه­های موتانت مشخص شده توسط هضم آنزیمی با ترادف یابی مورد تایید قرار گرفت. نتایج مربوط به حساسیت آنتی بیوتیکی بر روی 73 نمونه بالینی شیگلا نشان داد که 2/97 درصد از ایزوله ها حداقل به یکی از 18 آنتی بیوتیک مقاومت نشان می دهند و بیشترین میزان مقاومت به آنتی بیوتیک ها به ترتیب تری متوپریم+سولفامتوکسازول (5/ 94 درصد) و بعد از آن استرپتومایسین (2/93 درصد) و تتراسایکلین (2/93 درصد) بود. همچنین هیچ ایزوله ای به آنتی بیوتیک سیپروفلوکسازین و سفتی زوکسیم مقاومت نشان نداد. 23 (6/31 درصد) ایزوله مقاومت به نالیدیکسیک اسید را نشان دادند. همچنین تمامی نمونه های موتانت پس از PCR با استفاده از پرایمرDgyrAو سپس بدنبال انجام هضم آنزیمی الگوی باندی 234و277 جفت بازی را نشان داده و همین نمونه ها در مورد پرایمرLgyrAالگوی باندی315 و333 را به نمایش گذاشتند. نمونه های نرمال حاصل از تکثیر پرایمرDgyrAنیز پس از انجام RFLP قطعات99و178و234جفت بازی را نشان داده و همین نمونه ها در مورد پرایمرLgyrAقطعات99و234و315 جفت باز را نمایش دادند. تمامی نتایج با Sequencing تایید گردید. در خوانش کامل اولیه از موتانت های واجد موتاسیون در ژنgyrA، تغیر نقطه ای در کدون83 نشان داده شد که حاصل جایگزینی یک نوکلئوتید به نوکلئوتید دیگر بوده است. نتیجه این تغیر، جایگزینی اسید آمینه سرین به لوسین بود. در خوانش کامل دومین موتانت های واجد موتاسیون در ژنgyrA، تغیر نقطه ای در کدون83 نشان داده شد که حاصل جایگزینی یک نوکلئوتید به نوکلئوتید دیگر بوده است. از میان دو نمونه موتانت شیگلا 1 نمونه (50درصد) به سروتایپ شیگلا فلکسنری و 1 نمونه (50درصد) به سروتایپ شیگلا سونئی تعلق داشت. از میان 23 سویه مقاوم شیگلا مقاوم به نالیدیکسیک اسید، 4 نمونه واجد ژن qnrS بودند.