مکانیسم مقاومت به مونوباکتام ها:

آزترونام با بتالاکتامازهای وابسته به پلاسمید بسیار شایع موجود در بسیاری از انتروباکتریاسه ها به سرعت هیدرولیز نمی شود. با وجود این آنزیم هایی وجود دارد که مقاومت نسبت به آزترونام را به باکتری اعطاء می نمایند مثلا ظهور تدریجی بتالاکتامازهای وسیع الطیف نوعی از طرح مقاومت می باشد که کارایی آزترونام را تهدید می کند.اغلب ESBL ها، مشتقات قدیمی تر آنزیم های کد شونده پلاسمیدی هستند که ناحیه فعال آن ها دچار موتاسیون شده و هیدرولیز آزترونام و سفالوسپورین های وسیع الطیف شبیه سفتازیدیم و سفوتاکسیم در آن ها افزایش یافته است. معمول ترین ESBL های شناخته شده،TEM ، VIM، NDM  هستند که ابتدا در کلبسیلا پنومونیه و اشریشیاکلی شناخته شدند.با وجود این، این آنزیم ها در دیگر جنس های انتروباکتریاسه و در سودوموناس آئروژینوزا، بورخولدریا سپاشیا، شناسایی شده اند. اگر چه بسیاری از انتروباکتریاسه ها و سودوموناس آئروژینوزا با آزترونام از بین می روند این باکتری ها مقادیر کم از سفالوسپورینازهای AmpC کروموزومی را تولید می کنند. تولید مقادیر زیاد آنزیم های AmpC در موتانت ها، مقاومت نسبت به آزترونام و اغلب بتالاکتام های دیگر را فراهم می سازد.موتانت های آزمایشگاهی با حساسیت کمتر نسبت به آزترونام، نیز شده اند که از طریق مکانیسم های غیر آنزیمی سبب مقاومت می گردند. اغلب در این موتانت ها کاهش نفوذپذیری نسبت به دارو نشان داده شده است ( راندگر و همکاران ، 2000 ).

2-22-4.مقاومت به آمینوگلیکوزیدها:

در گزارشی که از ژاپن، کره، آمریکا بر روی اسینتوباکتر بومانی سویه (armA) اعلام شد نشان داده شد که وجود متیلاسیون 16SrRNA باعث ایجاد یک مکانیسم مقاومتی شد، بدین صورت که باعث جفت کردن نواحی اتصال آمینوگلیکوزیدها با جایگاه هدف خودش می شود در نتیجه مقاومت بسیار بالایی به تمام آمینوگلیکوزیدهایی که از نظر کلینیکی مفید بودند نظیر جنتامایسین، توبرامایسین، آمیکاسین نشان می داد.ژن armA توسط پلاسمید انتقال می یابد و داخل ترانسپوزون قرار دارد.

AbeM جزئی از خانواده پمپ های MATE می باشد و آمینوگلیکوزیدها سوبستراهایی برای پمپ AbeM می باشند ( مگنت و همکاران، 2001 ).

2-22-5. مقاومت به پلی میکسین ها:

در گذشته نشان داده شد که مقاومت نسبت به اشریشیاکلی، سالمونلا و سودوموناس آئروژینوزا به دلیل کاهش در جایگاه اتصال لیپوپلی ساکاریدها می باشد که باعث ایجاد مقاومت می شود. هم چنین تغییراتی که در پروتئین های غشای خارجی(OMPs) ایجاد شد باعث کاهش حساسیت نسبت به پلی میکسین ها می شد که در مورد سودوموناس آئروژینوزا گزارش شد. امروزه مقاومت اسینتوباکتر بومانی نسبت به پلی میکسین ها در شرایط in vitro گزارش شده اما مکانیسم های این مقاومت هنوز ناشناخته باقی مانده است(بنیفلا و- همکاران، 2004 ).

2-22-6.مقاومت به کینولون ها:

تغییراتی در DNA gyrase و یا توپوایزومراز IV طی موتاسیونی که در ژن های gyrA و parC که برای اسینتوباکتر بومانی شرح داده شد ایجاد شد که این موتاسیون باعث دخالت در جایگاه های اتصال هدف می شدند. مشابه آمینوگلیکوزیدها، بسیاری از کینولون ها سوبسترای پمپ های انتشار به خارج چندین دارو، نظیر پمپ های AdeABC که از نوع پمپ های RND و پمپ های AdeM که متعلق به پمپ های خانواده MATE هستند، بودند. هم چنین مقاومت های کینولونی که مرتبط با پلاسمید بود مربوط به ژن qnr بود که تاکنون در مورد اسینتوباکتر بومانی گزارش نشده است ( میلاتوویک و همکاران، 2000 ).

2-22-7.مقاومت به تتراسایکلین ها و تایگلسین ها:

مقاومت به تتراسایکلین ها و مشتقات آن ها مرتبط به پمپ ها و یا حفاظت ریبوزومی بود. پمپ های اختصاصی انتشار به خارج تتراسایکلین شامل آن هایی بود که توسط ژن های tet(A) تا tet(E) کد می شد که معمولا در ارگانیسم های گرم منفی یافت می شود.tet(A)  و tet(B) برای اسینتوباکتر بومانی شرح داده شد که tet(A) در یک ترانسپوزون مشابه با Tn1721 یافت شد و در ارتباط با عناصر IS بود.

tet(A) باعث ایجاد مقاومت نسبت به تتراسایکلین می شد ولی بر علیه مینوسایکلین ها که داروی قوی تری برای اسینتوباکتر بومانی می باشد به کار نمی آید. جدا از پمپ های اختصاصی انتشار به خارج تتراسایکلین، این کلاس از داروهای ضد میکروبی هم چنین نسبت به پمپ های انتشار به خارج چندین دارو نظیر پمپ AdeABC نیز حساس بودند. تایگلیسین که اولین داروی ضد میکروبی از کلاس تغییر یافته ی تتراسایکلین ها بود و به نام گلیسیل سایکلین شناخته شده بود نیز سوبستراهایی برای انتشار به خارج بود. با انجام دادن Real Time PCR بر روی ژن adeB، با افزایش MICs تایگلیسین، افزایش بیان adeB مشاهده شد.

نقش پمپ AdeABC در کاهش حساسیت به تایگلیسین توسط غیر فعال شدن ساختن ژن adeB مشخص شد که منجر به کاهش MIC تایگلیسین از 4 میکروگرم بر میلی لیتر به 5/0 میکروگرم بر میلی لیتر شد( فلویت و همکاران، 2005 ).

Magnet et al.

Benifla et al.

Milatovic et al.

مهارکنندگان بتالاکتامازها:

اولین مهار کننده بتالاکتاماز اسید کلاوولانیک می باشد،این آنتی بیوتیک از جهاتی با پنی سیلین ها تفاوت دارد که وجود اتم اکسیژن به جای اتم سولفور، عدم وجود زنجیره جانبی روی حلقه ی بتالاکتام و جانشینی Hydroxyethylidene روی حلقه اگزازولیدین از جمله تفاوت این عامل با پنی سیلین ها می باشند.

سه ترکیب سولفون های نیمه سنتیک اسید، سولباکتام و تازوباکتام دارای فعالیت ضد میکروبی بوده و جزء مهارکنندگان محسوب می شوند.

یک مهار کننده بتالاکتاماز در ترکیب با آموکسی سیلین، تیکارسیلین، آمپی سیلین و پیپراسیلین، فعالیت آن دارو را در مقابل سویه های تولید کننده بتالاکتاماز، هموفیلوس آنفلونزا، گونوکوک ها، موراکسلا کاتارالیس، گونه های کلبسیلا، استافیلوکوکوس و اشریشیاکلی افزایش می دهد. در حالی که فعالیت آن در مقابل دیگر باسیل های گرم منفی، به طور وسیعی توسط مهارکنندگان بتالاکتاماز بدون تغییر می ماند( برایورس و همکاران، 2005 ).

2-23-1.مکانیسم عمل مهارکنندگان بتالاکتامازها:

تازوباکتام به PBP1 و یا  PBP2متصل شده و به تنهایی فعالیت ضد باکتریایی بسیار ضعیفی را دارد. تازوباکتام به عنوان یک Suicidal Beta-lactamase Inhibitor عمل می کند. تازوباکتام، فعالیت خوبی در مقابل بتالاکتامازهای پلاسمیدی دارد ولی در مقابل بتالاکتامازهای کروموزومی قابل القاء انتروباکتریاسه ها فعالیت ضعیفی دارد.

اسید کلاوولانیک به وسیله تشکیل یک کمپلکس آسیل-آنزیم با بتالاکتاماز به عنوان Suicide Inhibitor عمل می کند که به کاهش فعالیت آنزیم بتالاکتاماز منجر می گردد.

بتالاکتامازهای TEM وابسته به پلاسمید در سویه های مقاوم به سفتازیدیم در کلبسیلا پنومونیه و اشریشیاکلی با این عامل غیر فعال می شوند، در حالی که بتالاکتامازهای قابل القاء(کلاس یک کروموزمی) در انتروباکتر، سراشیا، سیتروباکتر و سویه های سودوموناس با کلاوولانیک اسید مهار نمی شوند.

در بسیاری از باکتری ها، سولباکتام به عنوان یک مهار کننده موثر بتالاکتامازهای وابسته به پلاسمید و کروموزومی می باشد. این دارو در مقابل ارگانیسم هایی که به دلیل تولید بتالاکتاماز در مقابل بتالاکتام ها مقاوم می باشند، به طور سینرژیک با پنی سیلین ها و سفالوسپورین ها عمل   می کند( ولف و همکاران، 2000 ).

2-24.روش های شناسایی آنزیم های ESBL:

2-24-1-1.آزمایش مجاورت دو دیسک:

روش مجاورت دو دیسک(DDT) یک روش در تایید تولید ESBL می باشد. در این روش ارگانیسم مورد آزمایش، روی محیط کشت مولر هینتون آگار پخش می شود و یک دیسک حاوی آموکسی سیلین/کلاوولانات gμ10/gμ20 در وسط پلیت قرار داده می شود و دیسک های حاویgμ30 از سفتازیدیم، آزترونام، سفتریاکسون، سفوتاکسیم و یا سفودوکسیمgμ10 به فاصله ی 25 تا 30 میلی متری از آن قرار داده  می شود. افزایش و یا نامنظمی هاله ی مهار رشد ما بین دیسک سفالوسپورین ها و دیسک حاوی کلاوولانات نشان دهنده وجود ESBL می باشد. این روش، اولین تست بیان شده توسط Jarlier و همکارانش در شناسایی این آنزیم ها می باشد.این روش معمول بوده و انجام آن آسان و مقرون به صرفه می باشد ولی عیب این روش آن است که اگر تلقیح باکتری خیلی زیاد باشد و یا اگر دیسک ها خیلی دور از هم قرار داده شوند سینرژیسمی مابین دیسک آموکسی سیلین/کلاوولانات و سفالوسپورین به طور غیر عمده نادیده گرفته می شود، لذا برخی از محققین فاصله لبه به لبه mm15 بین دیسک ها را مطرح کرده اند که در این صورت حساسیت آزمایش خیلی بیش از زمانی است که فاصله بین دیسک ها 35-25 میلی متر در نظر گرفته شود( پویرل و همکاران ، 2007 ).

Brauers et al.

Wolff et al.

Double Disk approximation Test

در اسینتوباکتربومانی های ایزوله شده از بیماران شهرتهران

ترکیب دو دیسک:

جهت تایید آزمایش های غربالگری باکتری های تولید کننده ی آنزیم های بتالاکتاماز، CLSI در سال 1999 راهنمایی های لازم را ارائه داد. در یک تحقیق، باکتری همانند آزمایش مجاورت دو دیسک به صورت متراکم بر روی محیط کشت مولر هینتون آگار کشت داده شده و سپس چهار دیسک سفوتاکسیم-کلاوولانیک اسید، سفوتاکسیم، سفتازیدیم-کلاوولانیک اسید و سفتازیدیم با فاصله ی 15 میلی متر از یکدیگر روی آن ها قرار داده شدند، بعد از 24ساعت انکوبه کردن پلیت ها در دمای 37 درجه سلسیوس، در صورت مشاهده ی افزایش بیش از 5 میلی متر در قطر هاله هر کدام از آنتی بیوتیک های فوق در ترکیب با کلاوولانیک اسید نسبت به آنتی بیوتیک تنها، ارگانیسم ESBL مثبت و در غیر این صورت ارگانیسم ESBL منفی گزارش می شدند  ( واین2012).

2-24-1-3.آزمایش سه بعدی:

در این روش ابتدا باکتری که بتالاکتاماز منفی می باشد و به تمامی داروهای بتالاکتامی حساس می باشد را به صورت متراکم بر روی محیط کشت مولر هینتون آگار کشت داده و یک دیسک سفتریاکسون در مرکز پلیت قرار داده می شود. در پلیت چاهکی به فاصله ی 2 میلی متری دیسک ایجاد می شود و ژلوز آن قسمت تخلیه می گردد. سوسپانسیونی از باکتری مورد آزمایش با کدورت نیم مک فارلند تهیه کرده و داخل چاهک ریخته و پس از انکوباسیون 24 ساعته نتایج آزمایش مشاهده می شود. در صورتی که باکتری مورد آزمایش بتالاکتاماز مثبت باشد گسترش هاله ی عدم رشد باکتری حساس، به سمت دیسک مرکزی سفتریاکسون، در نواحی اطراف منطقه ی چاهک نشان دهنده ی تخریب دارو توسط این آنزیم و ایجاد امکان رشد برای باکتری حساس در حضور دارو می باشد.

2-25.شیوع بیمارستانی و ارزیابی میزان کنترل:

طریقه مصرف آنتی بیوتیک ها نیز باید تحت نظارت باشد تا آنتی بیوتیک هایی که مصرف آنها باعث خطر آفرینی می شود به میزان زیاد مورد استفاده قرار نگیرد. مطالعاتی نیز باید در مورد مصرف تک تک       آنتی بیوتیک ها صورت بگیرد تا مشخص شود که کدام آنتی بیوتیک ها باعث افزایش خطر شیوع سویه های اسینتوباکتر مقاوم به چند دارو می شود. اگرچه مصرف هر آنتی بیوتیک فعالی علیه باکتری های گرم منفی، همراه با ظهور سویه های اسینتوباکتر بومانی مقاوم به چند دارو می باشد، ولی سه گروه آنتی بیوتیکی هستند که بیشتر بر این امر دلالت دارند که شامل طیف وسیعی از کارباپنم ها، فلوروکینولون ها و سفالوسپورین ها       می شود. چندین مطالعه نشان می دهد، رعایت عواملی که در بالا ذکر شد می تواند تاثیر به سزایی در کنترل عفونت های ایجاد شده توسط اسینتوباکتربومانی داشته باشد.

بعضی از محققین پیشنهاد می کنند که برای ریشه کن کردن استقرار اسینتوباکتر می توان از تکنیک هایی نظیر استفاده از پلی میکسین به طور موضعی و یا تنفسی استفاده کرد. اگرچه از پیشنهاد چنین روش هایی به علت امکان ایجاد مقاومت ارگانیسم ها به پلی میکسین B امتناع می شود. بهتر است که برای تشخیص بهتر بیمارانی که این باکتری در آنها مستقر شده است، توجه بیشتری به آلودگی های محیطی شود و برای جلوگیری از انتقال بیماری به بیمار، بهبود بخشیدن و ارتقاء نظافت دست ها بسیار حائز اهمیت می باشد( سیفرت و همکاران، 1994 ).

در مطالعات پیشین منشاء متعددی برای انتقال اسینتوباکتر بومانی نظیر کاتترهای مکشی، ظروف آب مقطر، ظروف جمع آوری ادرار، لوله های دستگاه تهویه، ویال های مولتی دوز دارو و فیلترهای مرطوب کننده، مواد غذایی که از طریق داخل وریدی به بیمار داده می شدند شناسایی شده است( ویلر و همکاران، 2000 ).

ارتقای پاک سازی محیطی برای زدودن ارگانیسم از محیطی که بیماران می خواهند در آن بستری شوند ضروری می باشد. بهبود روش های جداسازی به منظور جلوگیری انتقال از طریق تماس و بالا بردن نظافت به ویژه نظافت دست ها باید انجام بپذیرد.

یکی دیگر از راه های جلوگیری از انتقال اسینتوباکتر بومانی، بستری کردن بیماران در اطاق های تک نفره می باشد که این امر در بسیاری از بخش ها غیر ممکن می باشد که هنوز هم مطالعات بیشتری برای شناسایی راه های کنترل و نفوذ اسینتوباکتر بومانی نیاز است.

Wayne

Three-Dimensionsl Test

Seifert et al.

Viller et al.

اپیدمیولوژی جهانی اسینتوباکتر بومانی:

در بیمارستان های آسیا و شرق میانه شیوع فراوانی از اسینتوباکتر گزارش شده است. میزان مقاومت در نمونه های Sentry در سال 2001 تا 2004 از 25% برای ایمی پنم و مروپنم،40% برای سفی پیم و سفتازیدیم، 40% برای آمپی سیلین-سولباکتام، 35% برای آمیکاسین و 45% برای سیپروفلوکساسین تجاوز می کرد.

2-27. روش مولکولی دخیل در بررسی باکتری های مولد آنزیم های بتالاکتاماز وسیع الطیف:

در حال حاضر، وظیفه ی تعیین هویت یک باکتری با قدرت تولید ESBL اختصاصی در نمونه های بالینی، بسیار پیچیده و حیاتی می باشد زیرا آزمایشات مجاورت دو دیسک، ترکیب دو دیسک و MIC با نوارهای E-test تنها به طور احتمالی وجود یک باکتری تولید کننده ESBL را روشن می کند.

در مطالعات اولیه معمولا تعیین نقطه ی ایزو الکتریک برای تعیین ESBL کافی بود و اکنون با وجود بیش از 172 نوع آنزیم تیپ TEM که بسیاری از آنها دارای نقطه ایزو الکتریک نزدیک به هم دارند این روش به تنهایی برای مدت طولانی مناسب نخواهد بود و این موضوع در ارتباط با آنزیم های تیپ bla_VIM و bla_NDM  نیز صدق می کند، بنابراین روش های دیگری نیز در دسترس می باشند.

روش های ژنوتایپینگ شامل روش های مبتنی بر PCR و غیر مبتنی بر PCR می باشند.

الف- روش های مبتنی بر PCR :

• Multiplex PCR
• Revers transcriptase PCR
• Real Time PCR
• Nested PCR

ب- روش های غیر مبتنی بر PCR :

• الیگو تایپینگ
• ریبو تایپینگ
• پروب ژنی
• پروفایل پلاسمیدی
• RAPD
• AFLP
• PFGE
• RFLP
• MLST

2-27-1. واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR):

تکنیک PCR در سال 1984 توسط کری مولیس ارائه شده است و امروزه به عنوان یک ابزار مهم در فعالیت های تحقیقاتی و بالینی محسوب می شود.

PCR برای تکثیر بخش های خاصی از مولکول DNA مورد استفاده قرار می گیرد این بخش ها ممکن است یک ژن کامل یا قسمتی از یک ژن یا سکانس های بین ژن ها باشند در بسیاری از روش های PCR قطعات DNA های هدف حداکثر 10 کیلو جفت باز(KB) دارند اگر چه در بعضی از روش های خاص قطعات بزرگتر حتی تا Kb40 را هم می توان تکثیر کرد.

بعضی از کاربردهای PCR شامل کلونینگ DNA به منظور تعیین توالی، فیلوژنی بر اساس DNA آنالیز عملکردی ژن ها، تشخیص بیماری های ارثی، انگشت نگاری ژنتیکی در تعیین والدین و جرم شناسی و تشخیص بیماری های عفونی می باشند.

در روش PCR سیکل های دمایی ایجاد می شود ابتدا با ایجاد حرارت و رساندن دمای محلول به نقطه ذوب DNA دو رشته DNA از هم جدا می شوند. در مرحله بعد با کاهش دما یک آنزیم DNA پلیمراز فعال شده عمل همانند سازی را انجام می دهد. DNAپلیمراز آنزیمی است که با بهره گرفتن از نوکلئوتیدها (مصالح ساختمانیDNA ) و رشته الگو و یک قطعه پرایمر قادر به همانند سازی است.

صحت نتایج PCR بستگی به انتخاب پرایمر مناسب دارد، پرایمرها قطعات کوچک پلی نوکلئوتیدی هستند و در آزمایشگاه به گونه ای طراحی و سنتز شده اند که دارای سکانس نوکلئوتیدی مکمل با ناحیه ^/3 در مولکول DNA مورد نظر هستند. بنابراین به طور اختصاصی فقط به این مولکول ها متصل می شوند چون آنزیم DNA پلیمراز به قطعات پرایمر متصل می شود در نتیجه فقط مولکول DNA هدف همانند سازی و تکثیر می گردد.

با اعمال تغییرات دمایی به طور متوالی و برنامه ریزی شده روند PCR تکرار گردیده و در هر مرحله DNA دو برابر می شود بنابراین تعداد مولکول های DNA به صورت تصاعدی و به نسبت 2n  افزایش    می یابد که n تعداد سیکل های دمایی است مثلا یک مکولکول DNA پس از 20 سیکل به 586/047/1 مولکول تکثیر می شود. در مرحله همانند سازی برای جدا نگه داشتن دورشته DNA باید دمای محلول بالا باشد بنابراین از یک نوع آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت استفاده می شود. اولین آنزیم که بدین منظور مورد استفاده قرار گرفت Polymerase Taq بود که از باکتری Thermus aquaticus بدست می آید.

واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR):

تکنیک PCR در سال 1984 توسط کری مولیس ارائه شده است و امروزه به عنوان یک ابزار مهم در فعالیت های تحقیقاتی و بالینی محسوب می شود.

PCR برای تکثیر بخش های خاصی از مولکول DNA مورد استفاده قرار می گیرد این بخش ها ممکن است یک ژن کامل یا قسمتی از یک ژن یا سکانس های بین ژن ها باشند در بسیاری از روش های PCR قطعات DNA های هدف حداکثر 10 کیلو جفت باز(KB) دارند اگر چه در بعضی از روش های خاص قطعات بزرگتر حتی تا Kb40 را هم می توان تکثیر کرد.

بعضی از کاربردهای PCR شامل کلونینگ DNA به منظور تعیین توالی، فیلوژنی بر اساس DNA آنالیز عملکردی ژن ها، تشخیص بیماری های ارثی، انگشت نگاری ژنتیکی در تعیین والدین و جرم شناسی و تشخیص بیماری های عفونی می باشند.

در روش PCR سیکل های دمایی ایجاد می شود ابتدا با ایجاد حرارت و رساندن دمای محلول به نقطه ذوب DNA دو رشته DNA از هم جدا می شوند. در مرحله بعد با کاهش دما یک آنزیم DNA پلیمراز فعال شده عمل همانند سازی را انجام می دهد. DNAپلیمراز آنزیمی است که با بهره گرفتن از نوکلئوتیدها (مصالح ساختمانیDNA ) و رشته الگو و یک قطعه پرایمر قادر به همانند سازی است.

صحت نتایج PCR بستگی به انتخاب پرایمر مناسب دارد، پرایمرها قطعات کوچک پلی نوکلئوتیدی هستند و در آزمایشگاه به گونه ای طراحی و سنتز شده اند که دارای سکانس نوکلئوتیدی مکمل با ناحیه ^/3 در مولکول DNA مورد نظر هستند. بنابراین به طور اختصاصی فقط به این مولکول ها متصل می شوند چون آنزیم DNA پلیمراز به قطعات پرایمر متصل می شود در نتیجه فقط مولکول DNA هدف همانند سازی و تکثیر می گردد.

با اعمال تغییرات دمایی به طور متوالی و برنامه ریزی شده روند PCR تکرار گردیده و در هر مرحله DNA دو برابر می شود بنابراین تعداد مولکول های DNA به صورت تصاعدی و به نسبت 2n  افزایش    می یابد که n تعداد سیکل های دمایی است مثلا یک مکولکول DNA پس از 20 سیکل به 586/047/1 مولکول تکثیر می شود. در مرحله همانند سازی برای جدا نگه داشتن دورشته DNA باید دمای محلول بالا باشد بنابراین از یک نوع آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت استفاده می شود. اولین آنزیم که بدین منظور مورد استفاده قرار گرفت Polymerase Taq بود که از باکتری Thermus aquaticus بدست می آید.

مراحل PCR :

• مرحله شروع: به مدت 1 تا 9 دقیقه، دمای محلول به 94 تا 96 درجه سلسیوس رسانده می شود(اگر پلیمراز ها به حرارت مقاوم باشند تا 98 درجه سلسیوس میرسانیم) این مرحله فقط برای DNA پلیمرازهایی ضروری است که نیازمند فعال شدن حرارت در روش PCR hot- start هستند.
• مرحله واسرشت: این مرحله اولین قسمت از سیکل های حرارتی منظم است و شامل حرارت دادن محلول به مدت 20 تا 30 ثانیه در دمای 94 تا 98 درجه سلسیوس است در این مرحله به علت گسستن پیوند های هیدروژنی بین نوکلئوتیدها DNA الگو و پرایمر ها از هم جدا می شوند و تک رشته های DNA حاصل می گردد.
• مرحله اتصال: دمای محلول به مدت 20 تا 40 ثانیه به مدت 50 تا 65 درجه سلسیوس کاهش می یابد. در این مرحله پرایمر ها به تک رشته های DNA الگو متصل می شوند و به طور طبیعی دمای اتصال در حدود 3 الی 5 درجه سلسیوس پایین تر نقطه ی ذوب پرایمر ها است. پیوند های هیدروژنی پایدار فقط زمانی شکل می گیرد که سکانس پرایمر و رشته الگو مکمل یکدیگر باشند. آنزیم پلیمراز پس از اتصال به هیبرید پرایمر الگو همانند سازی DNA را آغاز می کند.
• مرحله طویل شدن: دمای محلول در این مرحله باید متناسب با نوع DNA پلیمراز مورد استفاده باشد. دمای اپتیمم برای آنزیم Taq polymerase حدود 75 الی 80 درجه سلسیوس است که معمولا دمای 72 درجه سلسیوس انتخاب می شود. در این مرحله آنزیم DNA پلیمراز با بهره گرفتن از  dNTPهای موجود در محلول، یک رشته DNA ی جدید را در جهت ^/5 به ^/3 و در مقابل رشته های الگو        می سازد، مدت زمان این مرحله نیز باید متناسب با نوع DNA پلیمراز و طول رشته DNA باشد. در دمای بهینه، DNA پلیمراز در هر دقیقه یک هزار باز را پلیمریزه می نماید. در مرحله طویل شدن در صورت وجود سوبسترای کافی و تامین شرایط بهینه مقدار DNA در محلول PCR دو برابر می شود بنابراین در هرسیکل PCR غلظت DNA به صورت تصاعدی افزایش می یابد.
• مرحله طویل شدن: این مرحله پس از آخرین سیکل PCR به مدت 5 الی 15 دقیقه در دمای 70 الی 74 درجه انجام می شود تا اطمینان حاصل شود که همه تک رشته های DNA همانند سازی شده اند.
• نگهداری نهایی:در این مرحله محلول نهایی به مدت کوتاهی در دمای 4 الی 15 درجه سلسیوس قابل نگهداری است.
• الکتروفورز در ژل آگارز:نهایتا می توان محصولات PCR را بر روی ژل آگارز و همراه با مارکر وزن مولکولی الکترفورز نمود تا صحت انجام PCR بررسی شود.