موضوع…………………………………………………………………………………………
3
1-3 فرضیات………………………………………………………………………………………………….
7
1-4 اهداف پژوهش…………………………………………………………………………………………
7
فصل دوم :ی بر منابع
2-1 کلیات……………………………………………………………………………………………………..
8
2-1-1 تاریخچه گیاه آلوئه ورا……………………………………………………………………………
8
2-1-گیاهشناسی……………………………………………………………………………………………..
9
2-1-3 تکثیر…………………………………………………………………………………………………..
10
2-1-4 گونه ها…………………………………………………………………………………………………
11
2-1-5 نیازهای اکولوژیکی……………………………………………………………………………….
11
2-1-6 خواستگاه و دامنه انتشار…………………………………………………………………………
11
2-1-7 خواص دارویی و موارد استفاده……………………………………………………………….
12
2-1-8 موادموثره و ترکیبات……………………………………………………………………………..
12
2-2 کشت بافت گیاهی…………………………………………………………………………………….
15
2-2-1 تاریخچه کشت بافت گیاهی……………………………………………………………………
15
2-2-2 اهداف کشت بافت گیاهی………………………………………………………………………
16
2-2-3 تعریف کشت بافت گیاهی………………………………………………………………………
16
2-2-4 انواع کشت بافت گیاهی…………………………………………………………………………
17
2-2-5 بررسی اثرات فاکتورهای مختلف در محیط کشت………………………………………
18
2-2-6 نمک های غیرآلی…………………………………………………………………………………..
19
2-2-7 ویتامین ها…………………………………………………………………………………………….
19
2-2-8 منبع انرژی……………………………………………………………………………………………
19
2-2-9 عوامل فیزیکی………………………………………………………………………………………
20
2-2-10 ریزنمونه…………………………………………………………………………………………….
20
2-2-11 pHمحیط………………………………………………………………………………………….
20
2-2-12 چگونگی انتخاب محیط کشت……………………………………………………………….
20
2-2-13 ریشه زائی…………………………………………………………………………………………..
21
2-3 هورمون ها………………………………………………………………………………………………..
21
2-3-1 اکسین ها………………………………………………………………………………………………
21
2-3-2 سایتوکینین ها………………………………………………………………………………………..
22
2-4 کالوس زایی……………………………………………………………………………………………..
23
2-4-1 انواع کالوس………………………………………………………………………………………..
23
2-4-2 مراحل رشد کالوس……………………………………………………………………………….
24
2-4-3 اندازه گیری رشد کالوس……………………………………………………………………….
24
2-4-4 آلودگی در کشت کالوس……………………………………………………………………….
24
2-4-5 تاثیر هورمون ها در القای کالوس……………………………………………………………..
25
2-5 کنترل قهوه ای شدن……………………………………………………………………………………
29
2-6 تولید متابولیت های ثانویه……………………………………………………………………………
32
2-7 ریزازدیادی………………………………………………………………………………………………
34
2-7-1 ریزازدیادی گیاهان از طریق کشت بافت……………………………………………………
34
2-7-2 انتخاب ریزنمونه……………………………………………………………………………………
35
2-7-3 تاثیر هورمون ها در ریزازدیادی………………………………………………………………..
36
2-7-4 تاثیر هورمون ها در باززایی……………………………………………………………………..
40
فصل سوم : مواد و روش ها
3-1 مواد گیاهی………………………………………………………………………………………………
43
3-2 کشت بافت………………………………………………………………………………………………
43
3-2-1 تهیه محلول ذخیره محیط های کشت………………………………………………………….
43
3-2-1-1 تهیه محلول ذخیره عناصر ماکرو…………………………………………………………..
44
3-2-1-2 تهیه محلول ذخیره عناصر میکرو………………………………………………………….
44
3-2-1-3 تهیه محلول ذخیره آهن – سدیم…………………………………………………………..
44
3-2-1-4 تهیه محلول ذخیره ویتامین ها………………………………………………………………
44
3-2-1-5 هورمون ها………………………………………………………………………………………..
45
3-3- تهیه محیط کشت…………………………………………………………………………………….
45
3-4 ضدعفونی نمونه های گیاهی………………………………………………………………………..
45
3-4-1 ضدعفونی اندام گیاهی ………………………………………………………………………….
46
3-5 تهیه ریزنمونه……………………………………………………………………………………………
46
3-6 روش انجام پژوهش…………………………………………………………………………………..
47
3-6-1 تکثیر…………………………………………………………………………………………………..
47
3-6-2 ریزازدیادی…………………………………………………………………………………………..
47
3-6-2-1 اثر هورمون اکسین…………………………………………………………………………….
48
3-6-2-2 اثر هورمون سیتوکینین………………………………………………………………………..
48
3-6-3 تاثیر هورمون های اکسین بر روی القای کالوس…………………………………………..
48
3-6-4 تاثیر هورمون های اکسین بر میزان ترکیبات پلی فنلی…………………………………..
49
3-6-4-1 روش اندازه گیری ترکیبات پلی فنل……………………………………………………….
49
3-6-4-2 منحنی استاندارد پلی فنل ها………………………………………………………………….
49
3-7 صفات مورفولوژیکی مورد بررسی و روش اندازه گیری آن ها……………………………
50
3-7-1 تعداد برگ……………………………………………………………………………………………
50
3-7-2 تعداد ریشه…………………………………………………………………………………………..
50
3-7-3 طول برگ…………………………………………………………………………………………….
50
3-7-4 طول ریشه……………………………………………………………………………………………
50
3-7-5 تعداد روز تا القای کالوس………………………………………………………………………
50
3-7-6 درصد کالوس زایی………………………………………………………………………………..
50
3-7-7 مورفولوژی کالوس……………………………………………………………………………….
51
3-7-8 وزن خشک کالوس……………………………………………………………………………….
51
3-8 آنالیز آماری و تجزیه و تحلیل داده ها……………………………………………………………
51
فصل چهارم : نتایج
4-1 تاثیر هورمون سیتوکینین بر صفات رویشی…………………………………………………….
52
4-1-1 هورمون BAP……………………………………………………………………………………..
52
4-1-1-1 تعداد برگ……………………………………………………………………………………….
52
4-1-1-2 طول برگ………………………………………………………………………………………..
54
4-1-1-3 تعداد ریشه………………………………………………………………………………………
56
4-1-1-4 طول ریشه………………………………………………………………………………………..
58
4-1-2 هورمون Kin……………………………………………………………………………………….
60
4-1-2-1 تعداد برگ……………………………………………………………………………………….
60
4-1-2-2 طول برگ………………………………………………………………………………………..
62
4-1-2-3 تعداد ریشه………………………………………………………………………………………
64
4-1-2-4 طول ریشه………………………………………………………………………………………..
66
4-2 تاثیر هورمون اکسین بر صفات رویشی…………………………………………………………
68
4-2-1 هورمون NAA…………………………………………………………………………………….
68
4-2-1-1 تعداد برگ……………………………………………………………………………………….
68
4-2-1-2 طول برگ………………………………………………………………………………………..
71
4-2-1-3 تعداد ریشه………………………………………………………………………………………
73
4-2-1-4 طول ریشه………………………………………………………………………………………..
75
4-2-2 هورمون IBA………………………………………………………………………………………
77
4-2-2-1 تعداد برگ……………………………………………………………………………………….
77
4-2-2-2 طول برگ………………………………………………………………………………………..
79
4-2-2-3 تعداد ریشه………………………………………………………………………………………
81
4-2-2-4 طول ریشه………………………………………………………………………………………..
83
4-3 بررسی اثرمتقابل هورمون ها بر صفات رویشی………………………………………………..
85
4-3-1 تعداد برگ……………………………………………………………………………………………
85
4-3-2 طول برگ…………………………………………………………………………………………….
88
4-3-3 تعداد ریشه…………………………………………………………………………………………..
91
4-3-4 طول ریشه……………………………………………………………………………………………
94
4-4 بررسی تاثیر هورمون های اکسین بر روی القای کالوس……………………………………
96
4-5 بررسی تاثیر هورمون های اکسین بر روی میزان فنل…………………………………………
99
فصل پنجم : بحث
5-1 بحث……………………………………………………………………………………………………….
102
5-1-1 ریزازدیادی…………………………………………………………………………………………..
102
5-1-2 تعداد برگ……………………………………………………………………………………………
102
5-1-3 طول برگ…………………………………………………………………………………………….
106
5-1-4 تعداد ریشه…………………………………………………………………………………………..
108
5-1-5 طول ریشه……………………………………………………………………………………………
110
5-1-6 تاثیر اکسین ها برالقای کالوس………………………………………………………………….
111
5-2 پیشنهادات……………………………………………………………………………………………….
114
فهرست منابع…………………………………………………………………………………………………..
115
پیوست…………………………………………………………………………………………………………..
123
چکیده انگلیسی……………………………………………………………………………………………….
126
چکیده
گیاه دارویی صبرزرد با نام علمی (Aloe barbadensis Mill.) یکی از گیاهان دارویی به شمار می رود که به دلیل تولید اسانس های باارزش در صنایع داروسازی و بهداشتی استفاده های فراوانی دارد. استفاده از سیستم کشت بافت برای ریزازدیادی این گیاه، امکان تولید تعداد زیادی گیاهچه در مدت زمان کوتاه را دارد. با این هدف، پژوهشی بر روی امکان ریزازدیادی و تاثیر تیمارهای هورمونی مختلف بر خصوصیات رویشی گیاه آلوئه ورا در شرایط درون شیشه ای با استفاده از هورمون های BAP ، Kin ، IBA و NAA و نیز ترکیبی از هورمون های برتر انجام شد. پس از گذشت 35 روز، پارامترهای تعداد برگ، طول برگ، تعداد ریشه و طول ریشه ثبت و مورد ارزیابی قرارگرفت. پاسخ ریزنمونه ها بر روی صفات رویشی این گیاه در سطح 01/0 معنی دار بوده است. براساس نتایج حاصل حداکثر تعداد برگ در محیط کشت MS دارای5/1 میلی گرم بر لیتر BAP با میانگین تعداد برگ 73/4 عدد و 8/0 میلی گرم بر لیتر IBA با میانگین تعداد برگ 04/4 عدد، حداکثر ارتفاع برگ ها در محیط کشت MS دارای 5/1 میلی گرم بر لیتر کینتین با میانگین طول 43/5 سانتی متر و 8/0 میلی گرم بر لیتر IBA با میانگین طول 83/3 سانتی متر، حداکثر تعداد ریشه در محیط کشت MS دارای 5/0 میلی گرم بر لیتر کینتین با میانگین تعداد ریشه 29/4 عدد و 8/0 میلی گرم بر لیتر NAA با میانگین تعدادریشه 06/7 عدد و حداکثر طول ریشه در محیط کشت MS حاوی 1 میلی گرم بر لیتر کینتین با میانگین طول ریشه 50/5 سانتی متر و 8/0 میلی گرم بر لیتر NAA با میانگین طول ریشه 44/8 سانتی متر به عنوان هورمون برتر انتخاب شده و سپس ترکیبی از این هورمون ها در قالب طرح فاکتوریل به محیط کشت اضافه شدند به صورتی که حداکثر تعداد برگ در محیط MS دارای 1 میلی گرم بر لیتر BAP و 6/0 میلی گرم بر لیتر IBA با میانگین 79/4 عدد، بهترین ارتفاع برگ ها در محیط کشت MS دارای 1 میلی گرم بر لیتر کینتین و 6/0 میلی گرم بر لیتر IBA با میانگین طول 44/5 سانتی متر و محیط کشت MS دارای 5/1 میلی گرم بر لیتر کینتین بدون هورمون IBA با میانگین ارتفاع 43/5 سانتی متر به دست آمد. همچنین نتایج نشان داد که حداکثر تعداد ریشه در محیط حاوی 8/0 میلی گرم بر لیتر NAA با میانگین 06/7 عدد و طویل ترین ریشه در همین محیط کشت با میانگین طول ریشه 44/8 سانتی متر حاصل شد که بر این اساس به کارگیری این محیط های کشت جهت ریزازدیادی گیاه آلوئه ورا توصیه می شود..در بررسی تاثیر هورمون های اکسین بر القای کالوس مشخص شد که غلظت 5/1 و 2 میلی گرم بر لیتر هورمون 2,4-Dو غلظت 2 میلی گرم بر لیتر هورمون Picloram با میانگین تعداد 28 روز تا القای کالوس، غلظت 5/1 میلی گرم بر لیتر هورمون 2,4-D با 95% کالوس زایی و غلظت 5/1 میلی گرم بر لیتر هورمون Picloram با وزن خشک 23/0 گرم، بعد از 35 روز به عنوان بهترین هورمون ها در القای کالوس معرفی شدند. همچنین کلیه کالوس ها در غلظت های مختلف NAA ، نرم و به رنگ سبز می باشند اما در بقیه اکسین ها به رنگ زرد روشن مشخص شد. در بررسی تاثیر هورمون های 2,4-D ، NAA و Picloram بر میزان تولید ترکیبات فنلی، پاسخ ریزنمونه ها در سطح 01/0 معنی دار شد. همچنین نتایج حاصل از بررسی اثر هورمون های اکسین بر میزان تولید ترکیبات پلی فنولی در گیاه آلوئه ورا نشان می دهد که غلظت 5/1 میلی گرم بر لیتر از هورمون 2,4-D با میانگین 984/29 میلی گرم بر گرم بیشترین میزان ترکیبات پلی فنلی را در این گیاه تولید می کند. کلیه داده های این پژوهش با استفاده از نرم افزار Spss و در قالب طرح کاملا تصادفی براساس آزمون دانکن مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفته است.
کلمات کلیدی : کشت بافت، صبر زرد (Aloe barbadensis Mill) ، ریزازدیادی، کالوس، ترکیبات پلی فنلی
1-1 مقدمه:
بهبود كیفیت غذای مصرفی همیشه یكی از مهمترین دغدغه های بشری بوده است. ازاین رو اصلاح گیاهان به عنوان اصلی ترین منبع تولید موادغذایی، جهت افزایش كیفیت و كمیت مواد تولیدی همواره مورد توجه انسان بوده است. در چند دهه گذشته، با گسترش اطلاعات بیوشمیایی و كشف مسیرهای بیوسنتزی انواع متابولیت های تولیدی در گیاهان، همچنین شناخت دقیق تر ساختارهای ژنتیكی و دستیابی به روش های دستورزی ژنتیكی، امكان خلق گیاهانی با توانایی های خارق العاده در تولید انواع متابولیت های ضروری در گیاهان فراهم شده است. در سال های اخیر گیاهانی كه قدمت زیادی در رژیم غذایی و دارویی انسان دارند، به علت تاثیرات مطلوب متابولیت های تولیدی و نیز جایگاهی كه این متابولیت ها از نظر فرآیندهای انتقال ژن دراستانداردهای ایمنی زیستی دارند، در كانون توجه بسیاری از محققان رشته های مختلف اعم از كشاورزی، صنایع غذایی، دارویی و پزشكی قرارگرفته است (محمدی و ذوالعلی، اسفند1388). در حال حاضر حدود یک سوم داروهای مورد استفاده دارای منشاء گیاهی می باشند. کشورهای آسیایی بخصوص هند، چین و ایران سابقه بسیار طولانی دراین زمینه دارند. این گیاهان مواد زیستی بخصوص و فعال با مقادیر بسیار کم تولید می کنند که تحت عنوان متابولیت های ثانویه نام گذاری می شوند. در عصر جدید، دانشمندان علوم گیاهی با استفاده از آخرین تکنیک های عملی کشت بافت گیاهی، توانسته اند از انواع گیاهان، ترکیب های بسیار مفیدی را جهت مداوای بیماری های سخت و غیرقابل مداوا و موارد استفاده دیگر، بدست آورند. در طی چند دهه اخیر روشهای متفاوتی با استفاده از بیوتکنولوژی درزمینه پرورش محصولات گیاهی برتر ابداع شده است که از جمله آن ها می توان روش های ایجاد گونه های جهش یافته و پلی پلوئید را نام برد. کشت سلول، بافت ها و اندام های گیاهی امکان تکثیر سریع و انبوه بسیاری از گیاهان دارویی مهم و تولید متابولیت های ثانویه در شرایط این ویترو را فراهم می کند. مهمترین روش های تکثیر درون شیشه ای گیاهان، ریزازدیادی، اندام زایی ازطریق کالوس و جنین زایی سوماتیکی است. گزارش های متعددی در زمینه تکثیر گیاهان دارویی از طریق کالزایی وجود دارد. تولید کالوس قابلیت باززایی کالوس و ریشه زایی گیاهچه به عوامل متعددی بستگی دارد که مهمترین آن ها ژنوتیپ، ریزنمونه و شرایط فیزیولوژیک آنان، نوع محیط کشت و عناصرغذایی، عوامل فیزیکی و شرایط محیطی ازقبیل نور، دما، pH ، تنظیم کننده های رشد و ویتامین ها می باشد (باسو و چاند، 1996؛ ساتیش و بهاواناندان، 1988؛ شاسانی و همکاران1998).
1-2 اهمیت موضوع
کشت سلول، بافت و اندام های گیاهی امکان تکثیر انبوه و سریع گیاهان و تولید متابولیت های ثانویه را در شرایطIn Vitroفراهم می سازد. با استفاده از کشتIn Vitroگیاه، علاوه بر دسترسی به منبع اولیه دارو در شرایط کنترل شده و مستقل از محیط، افزایش تولید ترکیبات نسبت به گیاه و تولید ترکیبات جدید نیز امکان پذیر می گردد (بورگاد و همکاران، 2002).
گیاهان دارویی از هزاران سال پیش به عنوان یکی از مهمترین منابع دارویی کاربرد داشته اند. فناوری زیستی با استفاده از راهکارهایی نظیر کشت سلول، اندام ها و بافت ها، مهندسی ژنتیک و کاربرد نشانگرهای مولکولی قادر است کارایی و بهره وری گیاهان دارویی را به عنوان منابع تجدیدپذیر جهت تولید دارو افزایش دهد. کشت سلول، بافت ها و اندام های گیاهی امکان تکثیر سریع وانبوه بسیاری از گیاهان دارویی مهم را فراهم نموده است. گیاهان تکثیرشده از طریق کشت هایIn Vitroعاری از بیماری و از لحاظ ژنتیکی وکیفی یکنواخت می باشند (امیدی و فرزین، 1388).
کشت بافت گیاهی در زمینه گیاهان دارویی کاربردهای متعددی دارد که مهمترین آن ها عبارتند از: تکثیر انبوه و سریع گیاهان دارویی یکنواخت از لحاظ محتوای ژنتیکی وکیفی، حفظ گونه های گیاهی درحال انقراض از طریق نگهداری در شرایط انجماد و تولید متابولیت های ثانویه در شرایطIn Vitroاز طریق کشت سوسپانسیون سلولی و کشت اندام (مولاباگال وتسای، 2004؛ تریپاتی و تریپاتی، 2003).
روش های سنتی تكثیر گیاهان دارویی همانند سایر گیاهان شامل روش های جنسی (تكثیر با بذر) و غیرجنسی نظیر : قلمه، خوابانیدن، پاجوش و … می باشد. گیاهان تكثیر شده با بذر عمدتا از لحاظ ژنتیكی یكنواخت نیستند و گیاه حاصله دارای تمام خواص گیاه مادری نیست. به همین جهت تكثیر غیرجنسی به جنسی ترجیح داده می شود. روش های سنتی تكثیرغیرجنسی عمدتا با مشكلات متعددی از جمله محدودیت گیاه مادری و بازدهی پایین مواجه است. كشت بافت، نوعی تكثیر غیرجنسی است. مزیت تكثیر از طریق كشت بافت نسبت به سایر روش های مرسوم، تولید تعداد زیادی گیاه درمحیطin Vitroبا محتوای ژنتیكی یكسان و كیفیت یكنواخت، در زمان كوتاه تر و فضای نسبتا محدود می باشد (تریپاتی و تریپاتی، 2003).
فناوری زیستی قادر است كارآیی گیاهان دارویی را جهت تولید دارو افزایش دهد. كشت سلول، بافت ها و اندام های گیاهی امكان تولید سریع و انبوه ژنوتیپ های مطلوب با محتوای ژنتیكی یكسان و كیفیت یكنواخت، در زمان كوتاه تر و فضای محدود فراهم می سازد. امروزه تعداد زیادی از گیاهان دارویی از طریق ریزازدیادی قابل تكثیر می باشند (امیدی و فرزین، 1391).
تشکیل کالوس مرحله ای اساسی در کشت درون شیشه ای بسیاری از سلول ها و بافت های گیاهی و نیز برخی از روش های مهندسی ژنتیک است. برای مثال، کالوس های کشت شده در شرایط درون شیشه ای تکثیر شده و تعداد زیادی سلول ایجاد می کنند که از طریق اندام زایی یا جنین زایی رویشی قابلیت باززایی و تبدیل شدن به گیاه کامل را دارند. علاوه بر این، بافت کالوس عمدتا به عنوان بافت هدف برای دستکاری ژنتیکی استفاده می شود و تشکیل کالوس برای باززایی بافت های تراریخت لازم است. از کالوس های سست و نرم عموما برای ایجاد کشت سوسپانسون سلولی نیز استفاده می شود (اثنی عشری، 1388).
این گیاه در ایران با نام صبرزرد و یا شاخ بزی نیز معروف است. تنها گونه بومی موجود در ایرانآلوئه ورامی باشد كه در نواحی جنوب ایران و گونه آلوئه لیتورالیس در ارتفاعات بشاگرد می روید. از میان گونه های شناخته شده آلوئه، تنها 4 گونه آن برای انسان و دام خوراكی هستند كه گونه آلوئه ورا در صدر آن قرار دارد (میرزایی ندوشن و همكاران، 1383 و آگاروال، 2008).